药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1771-1777   PDF    
肉桂酰胺格尔德霉素的体内外抗肿瘤活性
李良, 刘红, 张胜华, 胡磊, 甄永苏     
中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050
摘要:探讨化合物肉桂酰胺格尔德霉素(CDG)的体内外抗肿瘤活性。采用MTT法检测肿瘤细胞增殖,免疫荧光法和Annexin V-FITC/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡,Transwell法检测肿瘤细胞迁移能力,Western blotting法检测肿瘤细胞中RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2蛋白水平。使用异种移植瘤裸鼠模型检测CDG对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用。结果表明:CDG对不同肿瘤细胞增殖具有抑制作用,IC50为13.6~67.4 μg·mL-1;CDG能够诱导肿瘤细胞凋亡,引起多种细胞形态学改变;同时,CDG还可降低肿瘤细胞迁移能力,减少RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2蛋白水平;体内实验结果显示,CDG毒性明显低于格尔德霉素(GDM),并且能够抑制人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长。
关键词肉桂酰胺     格尔德霉素     HSP90抑制剂     抗肿瘤药物    
Anticancer effect of 17-(6-cinnamamido-hexylamino-)-17-demethoxygeldanamycin:in vitro and in vivo
LI Liang, LIU Hong, ZHANG Sheng-hua, HU Lei, ZHEN Yong-su     
Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: In the present study, a new compound named 17-(6-cinnamamido-hexylamino-)-17-de-methoxygeldanamycin (CDG) was obtained by introducing the cinnamic acid (CA) group into the 17-site of geldanamycin (GDM). The anti-cancer effects of CDG in vitro and in vivo were evaluated. MTT assay was used to examine the inhibitory effect of CDG on the proliferation of MCF-7, HepG2, H460 and SW1990 cells. Immunofluorescent staining flow cytometry combined with Annexin V-FITC/PI staining were used to detect apoptotic cells. Transwell assay was used to analyze the effect of CDG on cell invasion and migration ability. Western blotting was used to detect the expression levels of RAF-1, EGFR, AKT, CDK4 and HER-2 of MCF-7, HepG2 and H460 cells. The toxicities of CDG and GDM were evaluated in mice. Using the subcutaneously transplanted MCF-7 xenograft in nude mice, inhibitory effect was evaluated in vivo. The results showed that CDG inhibited the proliferation of cancer cells (IC50: 13.6-67.4 μg·mL-1). After exposure to CDG for 48 h, most cells presented typical morphologic changes of apoptosis such as chromatin condensation or shrunken nucleus. The rates of apoptosis of MCF-7, HepG2, H460 and SW1990 cells incubated with 10 μg·mL-1 CDG were 23.16%, 27.55%, 22.21%, 20.47%, respectively. A dose-dependent reduction of migration of four cell lines was found after exposure to CDG. The decreased levels of RAF-1, EGFR, AKT, CDK4 and HER-2 showed that CDG possessed HSP90 inhibitory effect. The result of animal toxicity test on the mice suggested that CDG had lower toxicity than GDM. Meanwhile, CDG inhibited the growth of MCF-7 xenografts of athymic mice.
Key words: cinnamamide     geldanamycin     HSP90 inhibitor     anticancer drug    

微生物来源的天然产物化学结构独特、作用靶点多样,是抗肿瘤药物及其先导化合物的重要来源。目前临床应用的一些抗肿瘤化疗药物或小分子靶向药物以及一些正在进行临床和临床前试验的抗肿瘤候选药物均来自微生物代谢产物及其结构衍生物[1, 2]

作者在前期工作中分别从放线菌6011W和吸水链霉菌17997中分离得到肉桂酰胺 (cinnamamide) 和格尔德霉素 (geldanamycin,GDM)[3, 4]。肉桂酰胺 是肉桂酸酰胺化结构衍生物,通过作用于基质金属蛋白酶、抑制核苷转运等机制发挥其抗肿瘤活性[3, 5]。另外,以肉桂酸为母核合成的各种酯、酰胺、酰肼等衍生物均已被作为具有生物活性的先导化合物,进行了抗肿瘤活性研究[6]。格尔德霉素属苯醌安莎类抗生素,是热休克蛋白90 (HSP90) 特异性抑制剂[7]。研究表明,HSP90不但在多种肿瘤细胞内高表达[8],而且许多与肿瘤细胞分化、增殖、侵袭密切相关的靶点分子,如EGFR、HER2、RAF、ALK等靶蛋白的活性构象的形成,均受HSP90的调控,HSP90与肿瘤发生、发展过程密切相关[9, 10, 11, 12]。目前,已有数种格尔德霉素衍生物作为抗肿瘤靶向药物在进行不同阶段的临床试验。

然而肉桂酰胺单独用药的细胞毒活性不强,而格尔德霉素则具有明显的肝脏毒性[13]。本研究设想制备一种兼具肉桂酰胺和格尔德霉素结构的化合物 (图 1),克服肉桂酰胺单独用药疗效不足、格尔德霉素肝脏毒性的缺点,整合两者各自独特的作用机制,从而更好地发挥其抗肿瘤活性。

Figure 1 Chemical structure of 17-(6-cinnamamido-hexylamino-)- 17-demethoxygeldanamycin (CDG)
材料与方法

细胞系、实验动物及试剂 取人乳腺癌细胞系MCF-7、人肝癌细胞系HepG2、人肺癌细胞系H460及人胰腺癌细胞系SW1990 (购于美国ATCC,本实验室保种),贴壁生长于细胞培养瓶,培养于37 ℃、饱和湿度、含5% CO2的CO2培养箱。

雌性BALB/c (nu/nu) 裸鼠,6~8周龄,体重18~22 g,维通利华公司产品 [SPF级,许可证号: SCXK (京) 2007-0012]。雄性昆明种小鼠,6~8周龄,体重18~22 g,由中国医学科学院实验动物中心提供 [SPF级,许可证号: SCXK (京) 2005-0008]。

己二胺

(hexane diamine)、DIPEA (N,N-diiso- propylethylamine) 及HATU [O-(7-azabenzotriazol-1- yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate] 为百灵威公司产品; 肉桂酸 (cinnamic acid,北京化学试剂公司); 牛血清白蛋白 (BSA,北京元亨圣马生物技术研究所); PI、Hoechst 33258、细胞凋亡检测试剂盒 (碧云天生物试剂有限公司); MTT (华美生物工程公司); Transwell培养板 (Costar); 蛋白定量试剂盒 (BCATM Protein Assay Kit,Pierce); 预染蛋白分子量标准 (北京欣经科生物技术有限公司); 抗体为Santa Cruz和Cell Signaling Technology公司产品; HRP标记的羊抗兔、兔抗羊、羊抗小鼠IgG抗体及ECL发光试剂盒 (北京中杉金桥有限公司); 乙腈和三氟乙酸 (HPLC级) 为Fisher公司产品。其他常规化学试剂均为国产分析纯。

CDG制备 参考文献[14]方法,GDM (560 mg,1 mmol) 溶于二氯甲烷40 mL,向其中加入1,6-己二胺 (1.16 g,10 mmol)。室温、避光搅拌4 h,混合物用双蒸水洗3次。用硅胶柱以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱,纯化样品。获得中间产物17-hexamethylenediamine- 17-demethoxygeldanamycin (17-HDGA) 为紫色粉末,产率80%。17-HDGA溶于DMF,向其中加入肉桂酸 (148 mg,1 mmol)、HOBt (135 mg,1 mmol) 和DIPEA (129 mg,1 mmol),混合物室温搅拌24 h。粗品直接 用制备薄层色谱纯化,展开剂为氯仿-丙酮 (2∶1),Rf = 0.4处条带为目标紫红色产物,产率83%。经ESI-MS鉴定其分子离子峰 (m/z) 为797.8 [M+Na]+,确定该化合物的相对分子质量为774,分子式为C43H58N4O91H NMR (500 MHz,CDCl3) 鉴定结果略。

MTT法测定细胞存活率 取对数生长期细胞,消化计数后按细胞数4 000~6 000/孔接种于96孔细胞培养板。培养24 h后加入不同浓度的CDG,每组至少3个平行孔,给药48 h后向每孔中加入MTT溶

液(5 mg·mL-1) 20 μL,37 ℃温育4 h。吸出上清液,加入DMSO 150 μL,振荡10 min,使结晶物充分溶解。用酶标仪在570 nm处测定每个孔的吸光度 (A) 值。将各测试孔的A值减去本底A值,各平行孔的A值取平均数。细胞的存活率以T/C (%) 表示,T为加药组细胞的A值,C为对照组细胞的A值。T/C (%) = (T - 本底A值) / (C - 本底A值) × 100% 。根据T/C (%) 值绘制细胞生长曲线。根据细胞生长曲线计算CDG对肿瘤细胞增殖抑制作用的IC50值 (半数抑制浓度)。

免疫荧光法测定细胞凋亡

将盖玻片置于6孔板内,取消化后吹散的细胞种入细胞培养板内,接种细胞数为20 000/孔,培养过夜。加入不同剂量药物,于给药48 h后从培养箱中取出细胞培养板,吸尽培养液。PBS洗3次,乙醇固定10 min,PBS洗3次,吸尽液体。 加入Hoechst 33258染色液 (激发波长在350 nm,发射波长在460 nm) 0.5 mL,避光染色15 min。再用PBS洗2遍,每次3 min。滴加抗荧光淬灭液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,使细胞接触封片液。荧光显微镜下检测细胞染色后形态,照相。

Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡 按照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。简述如下: 各个细胞系在不同浓度的药物处理后,收集细胞; PBS洗2~3次,1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min,弃上清液; 细胞重悬于binding buffer 150 μL中,加入Annexin V-FITC 10 μL和PI 5 μL,轻轻混匀,避光室温反应15 min或4 ℃反应30 min; 再加入binding buffer 150 μL,进行流式细胞仪测定,采集荧光强度并用自带软件FACScan进行数据处理。

细胞迁移能力测定

取Transwell小室,用1% 明胶处理后,以无血清的RPMI 1640培养基于培养箱中平衡1 h。上室分别加入100 µL无血清的RPMI 1640培养基培养的肿瘤细胞及不同浓度的药物 (CDG 10、1及0.1 μg·mL-1,肉桂酰胺3及1 mmol·L-1),细胞数为2 500~4 000/孔。下室加入RPMI 1640培养基600 µL (含有20% 血清用以刺激细胞迁移) 和相应浓度的药物,同时设置相应对照组。置于CO2培养箱中培养8 h,然后弃去孔中培养液。用90% 乙醇常温固定30 min。用0.1% 结晶紫常温染色10 min,清水漂净。用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。用10% 乙酸 (100 µL/孔) 抽提10 min,于600 nm处测定OD值。细胞迁移抑制率计算公式为: 抑制率 (%) = [(OD对照组 - OD给药组) / OD对照组] × 100% 。每个细胞系进行3次迁移实验,取OD值的平均值进行计算。

Western blotting检测 配制12% SDS分离胶和5% 浓缩胶,电泳。取出凝胶,转PVDF膜。1% BSA封闭2 h,加入1∶1 000稀释的一抗,室温孵育2~3 h,TBST洗膜3次; 加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗,室温孵育2~3 h,TBST洗膜6次。以ECL试剂盒检测蛋白条带,凝胶成像系统照相并保存分析结果。

裸鼠体内抗肿瘤活性测定

将MCF-7细胞消化成单细胞 (细胞数1×107),无血清培养基洗1次,将细胞悬液0.4 mL注射至裸鼠右侧腋窝。待瘤块长至足够体积后,在生理盐水中剪成2 mm × 2 mm × 2 mm。移植到裸鼠右侧腋窝,待瘤块长至约100 mm3时,将动物分组,使每组动物的瘤块大小平均值接近。实验分为4组,每组6只裸鼠,在瘤块接种后的第7天 开始隔天给药 (腹腔注射)。CDG给药剂量分别为40、20及10 mg·kg-1。实验期间,每5天测量1次瘤块的长径 (a) 与短径 (b),并记录动物体重。根据公式V = ab2/2计算瘤块的体积,绘制肿瘤生长曲线,利用相对肿瘤体积 (RTV = Vt/V0,V0为给药前测量所得肿瘤体积,Vt为每次测量时的肿瘤体积) 计算抑瘤率,T/C (%) = (TRTV/CRTV) × 100% (TRTV: 治疗组RTV,CRTV: 对照组RTV)。

数据统计

实验结果以± s表示,多组间比较采用完全随机设计方差分析 (ANOVA),两组间比较采用Student’s-t检验,应用SPSS统计软件处理。

结果

1 CDG抑制肿瘤细胞增殖

采用MTT法,检测CDG对MCF-7、HepG2、H460、SW1990细胞增殖的影响。药物作用48 h后,CDG对MCF-7、HepG2、H460、SW1990细胞的IC50范围在13.6~67.4 μg·mL-1。结果表明,CDG对体外培养的4种肿瘤细胞均具有抑制细胞增殖的作用 (图 2)。

Figure 2 Antiproliferative action of CDG on MCF-7,HepG2,H460 and SW1990 cell lines. Cells were treated with different amounts of CDG for 48 h and subjected to MTT assay. n = 3,± s

2 CDG诱导肿瘤细胞凋亡

MCF-7、HepG2、H460、SW1990细胞经10 μg·mL-1 CDG作用48 h后,用DNA特异性荧光染料Hoechst 33258染色,固定后在荧光显微镜下观察,可以看到细胞出现典型的凋亡形态学变化,镜下可见染色质凝集、细胞核固缩、核碎裂、形成凋亡小体 (图 3A)。细胞凋亡过程中会发生磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine,PS) 翻转,运用Annexin V-FITC/PI双染法检测CDG对4种细胞凋亡的影响。10 μg·mL-1 CDG作用48 h后,细胞凋亡率明显升高,与对照组比较具有显著性差异 (图 3B和3C)。

Figure 3 Effect of CDG on apoptosis. A: MCF-7,HepG2,H460 and SW1990 cells were treated with CDG (10 μg·mL-1) for 48 h and then stained with the DNA-binding dye Hoechst 33258 (magnification,200×); B: Flow cytometric histograms of MCF-7,HepG2,H460 and SW1990 cells after being treated by CDG (10 μg·mL-1) for 48 h; C: Apoptotic (%) induced by CDG (10 μg·mL-1) determined with Annexin V-FITC/PI apoptosis assay. ***P < 0.001 vs control

3 CDG抑制肿瘤细胞迁移

在下室含有20% 血清培养基的刺激条件下,处于Transwell小室内的肿瘤细胞会向下层迁移。结果表明,CDG对肿瘤细胞在Transwell小室中的迁移率有一定的抑制作用。CDG对细胞的迁移抑制作用明显强于肉桂酰胺 (P < 0.05)。另外,CDG对MCF-7、HepG2、SW1990细胞的细胞迁移抑制作用强于H460细胞 (P < 0.05),见表 1

Table 1 Effect of CDG and CA on the migration of tumor cells

4 CDG对肿瘤细胞相关的靶点具有抑制作用

采用Western blotting方法检测CDG对MCF-7细胞中RAF-1、EGFR、AKT、CDK4蛋白水平的影响,以及对HepG2和H460细胞中RAF-1、EGFR、AKT、HER-2蛋白表达的影响。结果显示,CDG (10、1及0.1 μg·mL-1) 能降低RAF-1、EGFR、AKT、CDK4蛋白在人乳腺癌MCF-7细胞中的水平,同时也能降低RAF-1、EGFR、AKT、HER-2在HepG2和H460细胞中的水平 (图 4)。

Figure 4 Effect of CDG on the levels of RAF-1,EGFR,AKT,HER-2,CDK4 and β-actin of MCF-7,H460 and HepG2 cells determined by Western blotting analysis

5 CDG抑制人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长

整个实验过程中,CDG组的动物体重与对照组相比没有显著性差异,表明动物能够耐受CDG的注射剂量 (图 5A)。实验结果表明,CDG 40、20和10 mg·kg-1对MCF-7细胞移植瘤的生长有抑制作用,抑 瘤率分别为61.8%、45.9% 和15.4% (图 5B)。另外,CDG的毒性明显低于GDM,GDM在可耐受剂量下无体内抗肿瘤活性,结果未显示。

Figure 5 Inhibitory effects of CDG on the growth of breast cancer MCF-7 xenografts of athymic mice. A: Changes of body weight of nude mice bearing human breast cancer MCF-7 xenografts (n = 6/group). B: Inhibitory effects of CDG on the growth of breast cancer MCF-7 xenografts in nude mice (n = 6/group). Mice were treated for 20 times after tumor inoculation

讨论

本研究利用化学方法制备一种兼具肉桂酰胺和格尔德霉素结构的化合物,并对其体内、体外抗肿瘤活性进行了初步研究。实验结果显示,CDG对MCF-7、HepG2、H460、SW1990细胞增殖具有明显抑制作用,显示出一定的细胞毒活性。用免疫荧光方法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,发现CDG能够引起肿瘤细胞染色质凝集、细胞核固缩、核碎裂、形成凋亡小体,所检测的4种肿瘤细胞凋亡比率与对照组 比较明显升高。Transwell实验证明,CDG可以抑制肿瘤细胞迁移且作用强于肉桂酰胺。Western blotting实验结果显示,CDG能够明显降低RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2等相关靶蛋白在肿瘤细胞内的表达水平。动物实验结果表明,在可耐受剂量下CDG对MCF-7细胞移植瘤的生长均有抑制作用,而且毒性明显低于GDM。

针对作用靶点新颖、具有抗肿瘤活性的先导化 合物进行结构优化、改造,是研发新型抗肿瘤药物 的有效手段。以HSP90抑制剂GDM为例,目前正 在进行不同阶段临床试验的GDM衍生物主要包括17-AAG (17-allyl-17-demethoxygeldanamycin)、17- DMAG (17-demethoxy-17-N,N-dimethylaminoethyl­aminogeldanamycin)、IPI-504 (17-allylamino-17- demethoxygeldanamycin hydroquinone hydrochloride),用于治疗晚期或复发的实体瘤和多发性骨髓瘤[15, 16, 17, 18]。RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2等靶蛋白活性构象受HSP90调控,这些靶蛋白在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、分化过程中发挥重要作用。HSP90抑制剂能够抑制这些靶蛋白水平而诱导肿瘤细胞凋亡。在本研究中,CDG能够明显抑制肿瘤细胞中RAF-1、EGFR、AKT、CDK4、HER-2蛋白水平。这与文献[19, 20]报道的17-AAG、17-DMAG等HSP90抑制剂的作用特 点相似,说明CDG可能具有HSP90抑制剂活性。同时还发现,相同剂量CDG作用48 h后引起的细胞凋亡率明显高于作用24 h的细胞凋亡率。这种凋亡率的增加不能仅仅用作用时间长来解释,因为有研究报道GDM与HSP90形成复合体后,HSP90的构型会随着时间的延长逐渐改变,最后与GDM形成一种亲和常数很高、结合很牢固的复合体[21]。这种高亲和力复合体的形成明显有助于HSP90抑制剂诱导细胞凋亡,而且抑制细胞迁移,这也与本研究中CDG抑制肿瘤细胞迁移的结果相符。研究表明,细胞外HSP90参与调控ERK和基质金属蛋白酶2和9,进而影响肿瘤细胞上皮-间质转化。胞外HSP90功能受到抑制时,肿瘤细胞迁移能力降低[22]。CDG抑制肿瘤细胞迁移可能与这一过程相关。

体内评价模型在肿瘤候选药物研发中起到至关重要的作用。本研究利用人乳腺癌MCF-7移植瘤裸鼠模型评价CDG体内抗肿瘤活性,结果显示不同剂量CDG对裸鼠移植性肿瘤的生长均有抑制作用,且高剂量的CDG显示出更强的抑瘤效果,研究所使用的异种移植瘤裸鼠模型目前仍然是抗肿瘤药物体内药效评价的主要方法。另外针对肿瘤细胞某一单一靶点的抗肿瘤药物或治疗手段可能并不足以完全抑制肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭。将CDG与其他一线肿瘤治疗药物,如微管抑制剂紫杉醇、长春新碱,小分子靶向药物,顺铂类药物,甾体激素类药物,单克隆抗体药物等联合应用也值得进一步研究。已有研究报道[23],HSP90抑制剂与化疗药物及抗体药物联合应用可以逆转肿瘤细胞多药耐药。

本研究结果表明CDG具有体内、体外抗肿瘤活性。体外研究主要着重于药物对肿瘤细胞增殖凋亡、迁移的影响以及与肉桂酰胺活性的比较; 体内研究主要着重于CDG与GDM毒性的比较以及CDG对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长抑制作用的评价。研究结果为CDG的进一步研究提供参考依据。

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