药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1778-1784   PDF    
FGF21对MSG胰岛素抵抗小鼠的非酒精性脂肪肝的治疗作用及其机制研究
朱升龙1, 张振宇1, 任桂萍1, 叶贤龙1, 马蕾1, 于丹1, 韩苗苗1, 赵景壮2, 张天援1, 李德山1     
1. 东北农业大学生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 150030;
2. 中国水产科学院黑龙江水产研究所, 黑龙江 哈尔滨 150070
摘要:研究成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)对谷氨酸钠(MSG)肥胖小鼠非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的治疗作用及其作用机制。实验分为正常对照组、模型对照组、高剂量FGF21治疗组和低剂量FGF21治疗组。给药5周,给药期间每周监测小鼠体重,给药结束时测定血脂和血清胰岛素及转氨酶含量。Real-time PCR方法检测肝脏和脂肪组织内能量代谢调节关键基因表达。结果显示,治疗5周后,不同剂量FGF21均明显降低 MSG模型体重(P<0.01),纠正其血脂紊乱(P<0.01),减轻模型小鼠的肝内脂肪变性,恢复其肝脏细胞正常形态结构,并且可显著改善MSG模型鼠胰岛素抵抗状态。因此,FGF21能显著减轻MSG肥胖小鼠体重、改善胰岛素抵抗、逆转模型小鼠的肝内脂肪变性,这一发现为临床应用FGF21治疗非酒精性脂肪肝奠定了理论基础。
关键词成纤维细胞生长因子21     胰岛素抵抗     非酒精性脂肪肝     谷氨酸钠    
Therapeutic effect of fibroblast growth factor 21 on NAFLD in MSG-IR mice and its mechanism
ZHU Sheng-long1, ZHANG Zhen-yu1, REN Gui-ping1, YE Xian-long1, MA Lei1, YU Dan1, HAN Miao-miao1, ZHAO Jing-zhuang2, ZHANG Tian-yuan1, LI De-shan1     
1. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;
2. Heilongjiang River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China
Abstract: This study is to evaluate the therapeutic effect of fibroblast growth factor 21 (FGF21) on NAFLD in MSG-IR mice and to provide mechanism insights into its therapeutic effect. The MSG-IR mice with insulin resistance were treated with high dose (0.1 μmol·kg-1·d-1) and low dose (0.025 μmol·kg-1·d-1) of FGF21 once a day for 5 weeks. Body weight was measured weekly. At the end of the experiment, serum lipids, insulin and aminotransferases were measured. Hepatic steatosis was observed. The expression of key genes regulating energy metabolism were detected by real-time PCR. The results showed that after 5 weeks treatment, both doses of FGF21 reduced body weight (P<0.01), corrected dyslipidemia (P<0.01), reversed steatosis and restored the liver morphology in the MSG model mice and significantly ameliorated insulin resistance. Additionally, real-time PCR showed that FGF21 significantly reduced transcription levels of fat synthetic genes, decreased fat synthesis and promoted lipolysis and energy metabolism by up-regulating key genes of lipolysis, thereby liver fat accumulation was reduced and liver function was restored to normal levels. In conclusion, FGF21 significantly reduces body weight of the MSG-IR mice, ameliorates insulin resistance, reverses hepatic steatosis. These findings provide a theoretical support for clinical application of FGF21 as a novel therapeutics for treatment of NAFLD.
Key words: fibroblast growth factor 21     insulin-resistance     non-alcoholic fatty liver disease     MSG    

非酒精性脂肪肝病

(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD) 包括单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎,后者可以进展为肝纤维化和肝硬化,其发病机制尚不十分清楚[1]。其主要成因除了与环境、遗传等因素有关外,还与饮食习惯密切相关。高脂高糖的饮食习惯往往是非酒精性脂肪肝病后天形成的关键因素[2]。大量研究表明,NAFLD与胰岛素抵抗、氧化应激、脂肪细胞因子脂质代谢紊乱等因素密切相关[3]。因此,纠正脂代谢紊乱、改善胰岛素抵抗等,从源头上降低上述代谢疾病的危险因素一直是临床治疗的重点之一。由于NAFLD具有发病隐匿、发病时间长的特点,如控制不当则可进一步发展至脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化等疾病,对人体健康造成严重危害。目前,该病已成为除慢性病毒性肝炎和酒精性肝病以外最重要的肝脏疾病。因此,探讨NAFLD的发病机制并寻找有效治疗的药物已成为该领域的研究热点。

成纤维细胞生长因子21 (fibroblast growth factor 21,FGF21) 是近期发现的体内又一个代谢调节因子,属于成纤维细胞生长因子家族,其特异性作用于肝脏、脂肪、胰岛细胞且不依赖于胰岛素有效安全地调节血糖血脂的能力深得研究人员青睐[4]。除此之外,在动物实验上可以有效改善胰岛素抵抗,降低胰岛素浓度,显著降低血清中甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白的含量,显示其具有治疗NAFLD的潜能[5, 6, 7]

谷氨酸钠

(MSG) 引起的下丘脑性肥胖小鼠模型与人类饮食性重度肥胖极为相似,其显著特征是肥胖、轻度少食和活动减少,同时还具有明显的代谢综合征,如胰岛素抵抗、高血脂、高血压、糖脂代谢紊乱及非酒精性脂肪肝等,是一种典型的肥胖型非酒精性脂肪肝动物模型,被用于多种减肥降脂药物的评价[8]。而FGF21对MSG肥胖小鼠所引起的NAFLD、高胰岛素、胰岛素抵抗和高甘油三酯的作用如何,目前还没有这方面的报道。因此本文旨在探讨FGF21对MSG小鼠的肝功能、血脂的影响及其作用机制。

材料与方法 实验材料

鼠源FGF21 (mFGF21) 由本实验室构建[9]。血糖试纸 (深圳瑞迪恩科技公司); 胰岛素酶联免疫分析试剂盒 (R&D公司); Trizol试剂 (Invitrogen公司)。

MSG胰岛素抵抗肥胖小鼠模型的建立 取新生昆明种小鼠 [动物合格证号: SCXK (京) 2012-0001],于出生两天起,皮下注射L-谷氨酸钠4 g·kg-1[10, 11],连续21天后断乳,按雌雄分笼饲养。定期记录体重,观察体型变化。

动物分组及给药

选用4月龄雄性MSG小鼠进行葡萄糖耐量 (OGTT) 实验。根据其结果,选择具有明显胰岛素抵抗动物,并参考体重随机分为3组,模型对照组 (n = 8): 普通饲料加0.9% 生理盐水 (200 μL·d-1,腹腔注射); 高剂量FGF21治疗组 (n = 8): 普通饲料加FGF21 (0.1 μmol·kg-1·d-1,腹腔注射); 低剂量FGF21治疗组 (n = 8): 普通饲料加FGF21 (0.025 μmol·kg-1·d-1,腹腔注射)。连续给药5周。取周龄相近的小鼠 (n = 8) 作为正常对照组,普通饲料加0.9% 生理盐水 (200 μL·d-1,腹腔注射)。分笼饲养在动物室 (温度22~28 ℃) 中,明暗周期为12 h (6∶00~18∶00),天黑前投食,自由饮水。实验期间,不控制饮水饮食。

口服葡萄糖耐量试验

(OGTT) 给药4周后,取各组小鼠进行口服葡萄糖耐量试验。实验前夜小鼠禁食,第2天上午进行葡萄糖 (2 g·kg-1) 灌胃。于0、30、60及120 min分别测量各组小鼠的血糖。

标本留取

小鼠处死前夜禁食,第2天上午称重后经眼眶取血处死小鼠,离心所得血清用于测血糖、胰岛素、血脂、肝酶等指标。另取部分肝脏,固定于10% 甲醛溶液中用于HE染色。

血清胰岛素含量测定及生化指标测定

血甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白 (LDL-c)、高密度脂蛋白 (HDL-c)、谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)、碱性磷酸酶 (ALP) 的含量水平通过全自动生化分析仪 (BeckmanDX800,USA) 测定。血清胰岛素含量采用酶联免疫分析试剂盒 (R&D) 测定。胰岛素抵抗指数 (IR) 按稳态胰岛素评价指数 (HOMA) 计算: HOMA-IR = [空腹血清胰岛素 (mU·L-1) × 空腹血糖 (mmol·L-1)] / 22.5 (即HOMA-IR = FINS × FBG / 22.5)[12]

Real-time PCR检测肝脏及脂肪组织中能量代谢关键基因表达 实验结束后处死各组小鼠,每组选取5只小鼠用Trizol法提取肝脏及脂肪总RNA。以不同处理的肝脏和脂肪总RNA为模板,Oligo(dT)18为引物反转录合成cDNA。选用在肝脏组织中稳定表达的β-actin作为内参。按照Thermal Cycler DiceTM Real Time PCR (TaKaRa Code: TP800) 的使用说明书要求进行实验操作,检测FAS、Leptin、ACC1、ACC2、UCP-1、LDLR、LPL表达水平 (表 1)。

Table 1 The primer sequence of real-time PCR

组织病理学检测

取部分肝左叶,常规包埋,石蜡切片,进行HE染色,光镜下观察脂肪变性情况及炎症程度。

数据分析

实验数据均采用SPSS20.0软件进行分析,以mean ± SEM表示,两样本均数比较采用t检验。

结果 1 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠体重的影响

各组小鼠体重变化如图 1所示。实验过程中,模型对照组小鼠体重显著增加,至实验结束时体重达到 (54.3 ± 1.47) g,显著高于正常对照组 (34.2 ± 1.1) g。而高剂量FGF21治疗组小鼠给药 (1~4周) 期间体重显著下降,至第4周后体重基本维持在 (30.4 ± 0.94) g,与模型对照组相比差异极显著 (P < 0.01)。此外,低剂量FGF21治疗组小鼠给药1~3周体重缓 慢增长至 (40.6 ± 1.3) g,第4周后体重开始有所下降,实验结束时体重达到 (40.5 ± 1.21) g,与模型对照组相比差异具有统计学意义 (P < 0.01)。

Figure 1 Effect of FGF21 on body weight of MSG-IR mice. The MSG model mice were administrated once a day with saline (model control),0.1 μmol·kg-1 FGF21 (high),0.025 μmol·kg-1 FGF21 (low),separately,for 5 weeks,the age-matched normal mice were administrated once a day with saline (normal control),then stop the administration. n = 8,mean ± SEM. P < 0.05,**P < 0.01 vs model control group

2 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠口服葡萄糖耐量的影响

各组小鼠OGTT结果如图 2所示。口服葡萄糖后30 min,模型对照组小鼠血糖迅速上升至最高,达

到(14.7 ± 0.49) mmol·L-1,而正常对照组小鼠血糖为(10.7 ± 0.49) mmol·L-1,表明模型对照组小鼠存在一定程度的胰岛素抵抗。而高剂量FGF21治疗组及低剂量FGF21治疗组MSG小鼠血糖上升幅度显著低 于模型对照组,分别为 (11.6 ± 0.64) 和 (12.5 ± 0.81) mmol·L-1 (P < 0.05)。此外,实验30~120 min内,不同剂量FGF21治疗组小鼠血糖恢复至正常水平的速度明显快于模型对照组 (P < 0.01)。结果表明,FGF21治疗组MSG小鼠胰岛素抵抗程度得到显著改善。

Figure 2 Effect of FGF21 on blood glucose concentration by OGTT in MSG-IR mice. The oral glucose tolerance test (OGTT) was performed by gavage of a glucose bolus (2 g·kg-1 of body weight) after overnight fast,and blood glucose levels were determined at 0,30,60 and 120 min using the One Touch Ultra Meter through the tail tip. n = 8,mean ± SEM. P < 0.05,**P < 0.01 vs model control group
3 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠血清甘油三酯 (TG)总胆固醇 (TC)低密度脂蛋白 (LDL-c) 及高密度脂蛋白 (HDL-c) 的影响

各组小鼠血清脂谱变化如表 2所示。随着体重的 显著增加,模型对照组与正常对照组相比,小鼠血清TC、TG、LDL-c含量均显著升高 (P < 0.01)。与模型对照组相比,FGF21高剂量治疗组的TG、TC、LDL-c分别降低了68.5%、57.5%、81.9% (P < 0.01),而HDL-c升高了47.9% (P < 0.01)。FGF21低剂量治疗 组的TG、TC、LDL-c也分别降低了66.1%、49.6%、72.5% (P < 0.01)。以上结果均表明,FGF21可以显著改善MSG小鼠的高脂血症及高胆固醇血症。

Table 2 Effect of FGF21 on serum lipid parameters of MSG-IR mice. After 5 weeks of treatment,blood samples were collected for assessment of serum TC,TG,LDL-c and HDL-c levels using automatic biochemical analyzer (BeckmanDX800,USA). n = 8,mean ± SEM. **P < 0.01 vs model control group
4 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠空腹胰岛素含量及稳态胰岛素评价指数的影响

各组小鼠血清胰岛素含量及胰岛素抵抗指数结果如表 3所示。各组之间的空腹血糖 (FBG) 水平比较无差异 (P > 0.05)。模型对照组与正常对照组相比存在明显的胰岛素抵抗 (P < 0.01); 与模型对照组比较,不同剂量FGF21治疗组小鼠的空腹胰岛素和稳态胰岛素评价指数均显著低于模型对照组 (P < 0.01),表明FGF21可明显改善MSG小鼠胰岛素抵抗状态并使之趋于正常水平。

Table 3 Effect of FGF21 on FBG and FINS of MSG-IR mice. After 5 weeks of treatment,fasted blood glucose (FBG) was assayed using the One Touch Ultra Meter through the tail tip. Serum insulin levels were measured by R&D ELISA kit using Microplate Reader (Biotech Elx800). n = 8,mean ± SEM. **P < 0.01 vs model control group

5 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠肝细胞谷丙转氨酶 (ALT)谷草转氨酶 (AST) 及碱性磷酸酶 (ALP) 的影响

各组小鼠肝功能相关主要血清指标变化如表 4所示。模型对照组小鼠ALT、AST、ALP均显著高于正常对照组 (P < 0.01),表明模型对照组小鼠的肝脏功能严重受损。而不同剂量FGF21治疗组小鼠的ALT、AST、ALP均显著低于模型对照组 (P < 0.01),

Table 4 Effect of FGF21 on serum liver enzymes of MSG-IR mice. After 5 weeks of treatment,blood samples were collected for assessment of serum ALT,AST and ALP levels using automatic biochemical analyzer (BeckmanDX800,USA). n = 8,mean ± SEM. **P < 0.01 vs model control group

表明FGF21可显著改善肝脏功能。

6 FGF21MSG胰岛素抵抗小鼠肝脏和脂肪组织内能量代谢调节关键基因表达的影响

经过5周的治疗后,与模型对照组相比,不同剂量FGF21显著降低脂代谢合成相关基因表达,包括脂肪酸合成酶 (FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1 (ACC1)、乙酰辅酶A羧化酶2 (ACC2)。除此之外,FGF21还 能显著升高能量代谢关键基因表达如瘦素 (Leptin)、低密度脂蛋白受体 (LDLR)、脂蛋白脂肪酶 (LPL),并且通过上调解偶联蛋白1 (UCP-1) 降低能量利用效率。此结果表明FGF21可显著降低脂代谢合成关键基因表达,减少脂肪的合成,且上调脂肪分解关键基因表达,促进脂肪分解和能量代谢,从而降低了肥胖小鼠肝脏组织中脂肪的积累,可恢复肝脏的正常功能。见图 3

Figure 3 Effect of FGF21 on the changes in gene expression. Real-time PCR analysis of FAS,ACC1,ACC2,and LDLR mRNA expression in liver tissue and Leptin,UCP-1 and LPL mRNA expression in white adipose tissue (WAT),all were performed at the end of the study after overnight fast. Levels of FAS,ACC1,ACC2,LDLR,Leptin,UCP-1 and LPL mRNA transcripts were assessed by real-time PCR using SYBR green in liver or WAT samples from five mice of each treatment group at the end of the study. n =5,mean ± SEM. P < 0.05,**P < 0.01 vs model control group
7 MSG胰岛素抵抗小鼠肝脏的组织病理学改变

肉眼观察,高剂量FGF21治疗组小鼠肝脏呈暗红色,边缘锐利,质软,有弹性,切面光滑,与周围组织无粘连; 低剂量FGF21治疗组小鼠肝脏体积稍肿胀,包膜略紧张,边缘稍圆钝,色泽略发黄,切面有轻微油腻感,部分小鼠的肝脏与周围组织有轻度粘连; 模型对照组小鼠肝脏体积肿大严重,色泽严重发黄,表面无光泽,肝脏与周围组织粘连严重。

HE染色结果如图 4所示: 在光镜下,模型对照组肝细胞肿胀,胞浆可见大量空泡,以肝小叶中央区为重,空泡大小不等,以大为主; 高剂量FGF21治疗组肝细胞浆内可见较小的脂肪空泡,数量比较少; 低 剂量FGF21治疗组肝细胞浆内可见较大的脂肪空泡,数量比较少,表明FGF21治疗后MSG小鼠肝脏损伤得到很好的修复。

Figure 4 Effect of FGF21 on morphological characterization of liver. Samples of liver were resected and fixed in 10% formaldehyde phosphate buffer saline (PBS,pH 7.4),then embedded in paraffin,sectioned and stained with hematoxylin/eosin (HE). Finally samples of liver were analyzed microscopically (magnification,×20)

讨论

近年来,随着人们的生活水平不断提高,饮食习惯逐渐发生不合理的改变,各种代谢类疾病,如高脂血症、糖尿病、高血压呈逐年上升的趋势[13]。NAFLD发病机制尚不清楚,目前大多数学者认为肝脏脂肪累积、胰岛素抵抗起关键作用,反过来,肝脏脂肪变性又加重胰岛素抵抗[14]。因此,有学者认为肥胖特别是中心性肥胖和胰岛素抵抗是发生NAFLD的危险因素[15]

成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是近期发现的FGF家族的新成员,主要在肝脏和脂肪组织表达,显著地降低血糖、调节脂质代谢及改善胰岛素抵抗的作用受到医药工作者的广泛关注。尽管目前多项研究通过ob/ob、db/db及DIO动物模型中证实,FGF21可能通过降低体重尤其是体内脂肪含量从而达到改善脂质代谢、逆转肝内脂肪变性的效果[5, 6, 7, 16],但这种原发性或者长期高脂高糖诱导的动物模型无法模拟人类正常的饮食结构及发生脂肪肝的病理过程。

本实验采用MSG诱导的下丘脑性肥胖小鼠模型,此模型与人类饮食性重度肥胖极为相似,其显著特征是肥胖、轻度少食和活动减少,同时还具有明显的代谢综合征,如胰岛素抵抗、高血脂、高血压、糖脂代谢紊乱及非酒精性脂肪肝等,是一种典型的肥胖型非酒精性脂肪肝动物模型,能更好地模拟人类发生非酒精性脂肪肝的病理过程。

本研究观察到了FGF21能显著改善MSG肥胖 小鼠的非酒精性脂肪肝,并对其机制作了初步探索。Real-time PCR结果显示,与模型对照组相比,FGF21显著降低脂代谢合成相关基因转录水平,包括FAS、ACC1及ACC2。此外,FGF21还能显著升高能量代谢关键基因的转录水平,如瘦素、LDLR、LPL、UCP-1等。此结果表明,FGF21可显著降低脂代谢合成关键基因表达,减少脂肪的合成,且上调脂肪分解关键基因表达,促进脂肪分解和能量代谢,从而降低了肥胖小鼠肝脏组织中脂肪的积累,恢复肝脏的正常功能。正常情况下,瘦素可以通过厌食和产热作用减轻体重,通过减少脂肪酸酯化、增加氧化作用而降低肝细胞内甘油三酯含量。本实验室前期研究发现,在针 对瘦素缺失及瘦素受体缺失的ob/ob、db/db自发性 糖尿病肥胖小鼠的治疗过程中,FGF21虽然具有显著的降低血糖的能力,但其对体重及脂质代谢的调节作用远不如在MSG模型小鼠中的调节作用; 此间最大区别在于MSG模型中瘦素及瘦素受体完整存在,real-time PCR结果显示FGF21在MSG模型中可显著上调瘦素基因转录水平,推测FGF21可能在一定程度上依赖瘦素发挥其调节脂质代谢改善非酒精性脂肪肝的生物学效应。

肥胖和脂质代谢障碍引起甘油三酯和游离脂肪酸在肝细胞内蓄积,从而引起脂肪肝发生。解偶联蛋白1 (UCP-1) 具有调节脂质代谢的作用,并受脂质的反馈调节,从而抑制肥胖或脂质代谢障碍时脂质在肝脏沉积,阻止肝细胞脂肪变性,在脂肪肝的发生过程中起保护作用。Real-time PCR结果显示,FGF21可显著上调UCP-1基因转录水平,表明FGF21治疗后,可能使解偶联活性增加,使肝细胞在脂质底物供给过多时限制ATP合成,因为甘油三酯合成是一种ATP依赖过程,其结果有助于抑制脂质合成,限制脂质在肝细胞内沉积。

本研究表明,FGF21能显著减轻MSG肥胖小鼠体重、改善胰岛素抵抗、逆转模型小鼠的肝内脂肪变性。今后的研究工作将集中于进一步阐明FGF21改善非酒精性脂肪肝的机制; 研究FGF21对胰岛素抵抗状态下其他心血管疾病的影响。期望能拓展FGF21的临床应用范围,为FGF21应用于临床治疗非酒精性脂肪肝尤其是胰岛素抵抗所并发的心血管系统疾病提供实验依据。

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