药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1792-1799   PDF    
氮杂吲哚类PARP-1抑制剂的合成及活性评价
周洁, 朱枝祥, 陈晓光, 徐柏玲     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室, 北京 100050
摘要:PARP-1通过催化ADP-核糖单元(ADP-ribose)从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)转移至各种底物蛋白上,参与损伤DNA的修复过程,是潜在的新机制的抗肿瘤药物靶标。本文设计合成了新结构氮杂吲哚类目标化合物16个,获得了对PARP-1具有抑制活性的化合物8个,其中2-位为脂环胺取代的氮杂吲哚对PARP-1和PARP-2均有抑制活性。
关键词PARP-1     抑制剂     氮杂吲哚     抗肿瘤药物    
Synthesis and activity evaluation of PARP-1 inhibitors with azaindole skeleton
ZHOU Jie, ZHU Zhi-xiang, CHEN Xiao-guang, XU Bai-ling     
State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of Active Substance Discovery and Druggability Evaluation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: PARP[poly(ADP-ribose)polymerase] represents a novel potential target in cancer therapy. It is involved in a DNA repair process by catalyzing the transfer of ADP-ribose units from NAD+ to a number of its substrate proteins. In this work, a series of novel azaindole derivatives was designed and synthesized. Moreover, 16 target molecules were screened and 8 compounds displayed inhibitory activity against PARP-1. It has been demonstrated that these azaindoles bearing cycloamine substituents at 2-position were active to both PARP-1 and PARP-2.
Key words: PARP-1     inhibitor     azaindole     antitumor agent    

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly(ADP-ribose) polymerase,PARP] 存在于真核细胞中,催化ADP-核糖单元从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+) 转移至各种蛋白底物上。PARP酶包括18个亚型,其中PARP-1在细胞内含量最高,在DNA损伤修复中发挥着约90% 的功能,是研究最为深入的一个亚型[1, 2]。当外界因素干扰如对肿瘤的放疗或化疗,以及DNA复制过程中,可产生断裂的DNA。PARP-1可识别断裂的DNA,很快被激活,并以NAD+为底物,将聚腺苷二磷酸核糖基转移到一系列蛋白底物的谷氨酸残基上,启动DNA的损伤修复过程[3, 4, 5]。因此,PARP-1在DNA损伤修复中具有重要的作用。已有研究表明,抑制PARP-1的活性,可以克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,增加肿瘤细胞对细胞毒类化疗药物的敏感性[6]。此外,已有实验数据提示,PARP-1抑制剂可单独用于BRAC1/2缺陷性乳腺癌,有可能发展成为低毒性、高选择性抗肿瘤药物[7, 8]。因此,PARP-1抑制剂的研究得到了广泛的关注。

上个世纪80年代,以PARP-1为靶点的药物研究就已开始,主要针对肿瘤、神经系统损伤和炎症损伤等疾病; 其中,PARP-1抑制剂作为抗肿瘤药物的研究最为广泛,已有多个候选药物进入临床试验阶段 (图 1)[9, 10, 11, 12]。由于PARP-1的内源性底物为NAD+,目前已有的PARP-1抑制剂大多模拟NAD+ 中烟酰胺结构,作用于PARP-1的催化活性位点而发挥抑制活性。

Figure 1 Chemical structures of known PARP-1 inhibitors and target compounds

已有PARP-1抑制剂构效关系表明[13, 14, 15, 16],甲酰 胺基作为氢键接受体和供给体,是PARP-1抑制剂重要的药效团特征之一。基于已知的苯并咪唑类 (如ABT-888) 和吲唑类 (如Merck-4827,图 1) PARP-1抑制剂,采用生物电子等排原理,本文设计了含有N-杂吲哚骨架的新结构化合物(8h8n9a9g12a12b,图 1),并考察2-位取代基结构变换对PARP-1抑制活性的影响。

目标化合物(8h8n9a9g) 的合成方法如合成路线1所示。以2-氨基-3-甲基吡啶为起始原料,与(Boc)2O反应,得到氨基保护的中间体1,收率为66%。采用Reissert吲哚合成方法,在正丁基锂的条件下,化合物1与草酸二乙酯发生取代反应,所得中间体在6 mol·L-1盐酸作用下,关环生成N-杂吲哚化合物2,收率为55%。化合物2被间氯过氧苯甲酸氧化,生成氮氧化物的间氯苯甲酸盐3,收率90%。化合物3与K2CO3的饱和水溶液反应后,抽滤,干燥,然后在四甲基溴化铵及甲磺酸酐的作用下,转化为溴代化合物4,收率64%[17, 18]。在DMAP和三乙胺的作用下,化合物4与对甲苯磺酰氯反应,生成化合物5,收率63%。化合物5在钯催化下与氰化锌发生偶联反应, 生成化合物6,收率75%[18]。值得一提的是,在制备关键中间体6时,依据文献[19]将化合物4与三氯氧磷在80~90 ℃反应,以63% 的收率得到2-乙氧羰酰基- 4-氯-7-N-杂吲哚,将吲哚环NH采用对甲苯磺酰基保护后,再与氰化锌反应,尝试多种反应条件,均未能得到预期化合物6。以NaOH为碱,DMSO为溶剂,加入H2O2的条件下,化合物6中氰基发生水解[20, 21],得到关键中间体7,收率为69%。如果不加H2O2,以1 mol·L-1的NaOH为碱,乙醇为溶剂,控制温度在 35 ℃左右进行水解,化合物6中的氰基可水解生成酰胺和羧酸产物,很难分离,核磁波谱显示比例为7∶1,总收率为70%。以EDC和HOBt为缩合剂,化合物7与不同的胺发生缩合反应,得到化合物8a8n,收率为14%~50%。其中,化合物8a8g中的Boc保护基在TFA的条件下脱除,得到目标化合物9a9g,收率为32%~67%。

Scheme 1 Synthetic route of azaindole derivatives 8a-8n,9a-9g

Reagents and conditions: a) (Boc)2O/n-hexane/ethyl acetate/60 ℃; b) n-BuLi/diethyl oxalate/THF/-15 ℃ and then 6 mol·L-1 HCl/reflux; c) m-CPBA/ether/DCM/rt; d) K2CO3/H2O and then (CH3)4NBr/methanesulfonic anhydride/DMF/acetonitrile/0 ℃ rt; e) p-TosCl/DMAP/ Et3N/DCM/40 ℃; f) Zn/Zn(CN)2/Pd(PPh3)4/dppf/DMF/Ar/60 ℃; g) NaOH/DMSO/H2O2/30 ℃; h) EDC/HOBt/Et3N/DMF/rt; i) TFA/ DCM/rt

目标化合物12a12b的合成方法如合成路线 2所示。以NaH为碱,化合物8n发生分子内N烷基化反应,关环生成化合物10,收率为70%。以Cs2CO3为碱,化合物10N-Boc-哌啶-4-对甲苯磺酸酯或N-Boc-四氢吡咯-3-对甲苯磺酸酯反应,分别得到化合物11a11b,收率为60% 和33%。化合物11a11b在TFA的条件下,脱除Boc保护基,得到目标化合物12a12b,收率分别为29% 和44%。

Scheme 2 Synthetic route of azaindole derivatives 11a,11b,12a and 12b

Reagents and conditions: a) NaH/THF/0-35 ℃; b) Cs2CO3/DMF/60 ℃; c) TFA/DCM/rt

结果与讨论 1 化学合成

化合物8a8n9a9g11a11b12a12b均未见文献报道,其结构经1H NMR、HR-MS (ESI)确证,收率、理化常数及波谱数据见表 1

Table 1 Physical constants and spectral data of compounds 8a-8n,9a-9g,11a,11b,12a and 12b
2 PARP-1酶抑制活性

本文利用NAD+ 化学定量法评价了所有目标化合物8h8n9a9g12a12b对PARP-1酶的 抑制作用。化合物8j8n12a12b对PARP-1没有抑制活性,其余化合物对PARP-1抑制活性的IC50值见表 2。已有研究表明[22],除PARP-1外,PARP-2是PARP家族中能够参与DNA损伤修复的另一亚 型,在DNA损伤修复中发挥着约10% 的作用,因此在DNA的损伤修复过程中,PARP-1和PARP-2具有协同作用,其中PARP-1发挥主导作用。由于PARP-1和PARP-2的催化域具有较高的同源性(69%),目前已知的PARP-1抑制剂,通常对PARP-2也具有抑制活性[14, 23, 24]。因此,本文也评价了部分活性化合物对PARP-2的抑制活性,抑制活性的IC50值见表 2

Table 2 Inhibitory activities against PARP-1 and PARP-2 of compounds 9a-9g,8h and 8i. IC50: Compound dose required to inhibit the PARP-1 and PARP-2 activity by 50%; NA: Not active; ND: Not determined

在目标化合物9a9f中,R2基团为含氮脂肪杂环胺,化合物对PARP-1均有一定的抑制活性 (IC50值为14.08~23.47 μmol·L-1),其中五元脂肪杂环和六元脂肪杂环取代的化合物对PARP-1的抑制活性无明显差别。但将化合物9a (IC50 = 16.59 μmol·L-1) 中酰胺的N原子甲基化后,所得化合物9g对PARP-1的抑制活性消失,推测可能是由于空间位阻的影响造成活性丧失。与9a9f比较,在化合物8i8m中,R1为取代苯胺或杂环芳胺,化合物对PARP-1的抑制作用显著降低或抑制活性消失。当R1为甲氨基时,化合物8h对PARP-1有较弱的抑制活性 (IC50 = 93.95 μmol·L-1),当R1为2-氯乙氨基时,化合物8n对PARP-1没有抑制活性。化合物12a12b是将化合物8n中的2-氯乙氨基侧链与氮杂吲哚的1位N原子发生环合,得到了三环类化合物,但该类化合物丧失了对PARP-1的抑制活性。与化合物9a9c比较,推测可能是由于环合作用,将化合物12a12b中2-位侧链构象限制在非活性构象中。

对PARP-1有较好抑制活性的化合物9a9f,测定了它们对于PARP-2的抑制活性。如表 2所示,化合物9a9f对PARP-2的抑制活性与对PARP-1的抑制活性相当。虽然化合物9a9f对PARP-1具有抑制活性,但抑制作用弱于文献报道的苯并咪唑和吲哚类化合物。推测可能的原因在于: 苯并咪唑和吲哚类化合物中,关键药效基团甲酰胺可通过分子内氢键,将甲酰胺的构象锁定在活性构象中[25],减少了小分子与PARP-1结合过程中的熵损失,对结合力有较大贡献; 在氮杂吲哚类化合物中,甲酰胺基团具有较大的柔性,不能通过分子内氢键将其锁定在活性构象中,导致该类化合物对PARP-1抑制活性降低,这为进一步结构修饰该类化合物提供了有益的启示。

3 小结

本文设计合成了新结构的氮杂吲哚类化合物,优化了4-氨甲酰基氮杂吲哚骨架的合成。评价了所有目标化合物对PARP-1的抑制活性,发现氮杂吲哚2-位侧链为脂环胺取代的化合物对PARP-1具有抑制活性,为发现新结构的高活性PARP-1抑制剂提供了一些有益的启示。

实验部分

熔点仪(MP-J3); 核磁共振仪 (Varian 300 MHz,Varian 400 MHz Plus); 质谱仪 (Thermo Exactive Plus); 所用试剂均为市售分析纯。

1 化学合成 1.1 2-Boc-氨基-3-甲基吡啶的合成 (1)

将Boc酸酐(10.1 g,46.5 mmol) 溶于12 mL正己烷,升温至58 ℃,将2-氨基-3-甲基吡啶 (3.1 g,28.7 mmol) 的乙酸乙酯4 mL溶液缓慢滴加至上述反应瓶中,滴加完毕,继续在58 ℃下反应6 h。冷却至室温,加入正己烷6 mL,室温搅拌,有固体析出,抽滤,滤饼用正己烷洗,用乙酸乙酯和石油醚重结晶得到白色固体3.3 g,收率56%。mp 139~140 ℃; 1H NMR (400 MHz,acetone-d6) δ 8.19 (d,J = 4.4 Hz,1H),7.60 (d,J = 7.2 Hz,1H),7.10 (dd,J = 7.2,4.8 Hz,1H),2.27 (s,3H),1.47 (s,9H)。

1.2 2-乙氧羰酰基-7-N-杂吲哚的合成 (2)

将2-Boc-氨基-3-甲基吡啶 (1.66 g,8 mmol) 溶于15 mL四 氢呋喃中,在冰盐浴下滴加1.6 mol·L-1的正丁基锂7.5 mL (18.75 mmol),滴毕继续在冰盐浴下搅拌反应1 h。将上述混合液转移至0 ℃条件下的草酸二乙酯 (2.17 ml,16 mmol) 四氢呋喃溶液 (15 mL) 中。继续在0 ℃条件下反应2 h后,加入6 mol·L-1盐酸9 mL,回流反应2 h后室温过夜。次日用氢氧化钠溶液调 pH至3,用乙酸乙酯 (50 mL×3) 萃取,合并有机层,分别用饱和碳酸氢钠溶液 (20 mL×3)、饱和氯化钠 溶液(20 mL×3) 洗有机相,无水硫酸镁干燥,浓缩得粗品。用乙酸乙酯和石油醚重结晶,得到白色固体650 mg,收率42.7%。mp 151~152 ℃; 1H NMR (400 MHz,acetone-d6) δ12.20 (brs,1H),8.52 (d,J = 4.0 Hz,1H),8.14 (d,J = 7.6 Hz,1H),7.19 (m,2H),4.41 (q,J = 7.2 Hz,2H),1.39 (t,J = 7.2 Hz,3H); HR-MS (ESI): m/z,calcd. for C10H11O2N2 [M+H]+ 191.081 5,Found: 191.081 1。

1.3 2-乙氧羰酰基-7-N-氧杂吲哚间氯苯甲酸盐的合成 (3)

将2-乙氧羰酰基7-N-杂吲哚 (150 mg,0.789 mmol) 溶于正己烷和乙醚 (6 mL,V正己烷V乙醚 = 2∶1) 的混合溶液中,加入间氯过氧苯甲酸 (224 mg,0.947 mmol),室温搅拌反应48 h后停止反应,抽滤,滤饼用正己烷和乙醚的混合溶剂 (18 mL,V正己烷V乙醚 = 3∶1) 洗,干燥后得到类白色固体250 mg,收率87.7%。1H NMR (300 MHz,acetone-d6) δ8.39 (d,J = 6.3 Hz,1H),7.98 (m,2H),7.88 (d,J = 8.1 Hz,1H),7.67 (d,J = 7.5 Hz,1H),7.55 (t,J = 8.1 Hz,1H),7.31 (s,1H),7.26 (dd,J = 7.8,6.3 Hz,1H),4.39 (q,J = 7.2 Hz,2H),1.37 (t,J = 7.2 Hz,3H)。

1.4 2-乙氧羰酰基-4--7-N-杂吲哚的合成 (4)

将2-乙氧羰酰基-7-N-氧杂吲哚间氯苯甲酸盐 (4 g,11.08 mmol) 加到15 mL水中,化合物几乎不溶解,室温下滴加碳酸钾的饱和溶液,滴加过程中反应物全部溶解,继续滴加有固体析出,至pH值为10左右停止滴加,抽滤,滤饼干燥后,加入N,N-二甲基甲酰胺30 mL和四甲基溴化铵 (2.56 g,16.62 mmol),冰浴搅拌下滴加甲磺酸酐 (3.85 g,22.16 mmol) 的乙腈溶液30 mL,滴毕,冰浴下搅拌后自然升至室温反应,次日,停止反应,加入水100 mL,用氢氧化钠溶液调pH值至7左右,抽滤,滤饼水洗,干燥,得到淡黄色固体1.5 g,收率51.7%。mp 160~162 ℃; 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ12.93 (s,1H),8.27 (d,J = 4.8 Hz,1H),7.46 (d,J = 4.8 Hz,1H),7.04 (s,1H),4.35 (q,J = 6.8 Hz,2H),1.34 (t,J = 6.8 Hz,3H); HR-MS (ESI): m/z,calcd. for C10H10O2N2Br [M+H]+ 268.992 0,Found: 268.992 1。

1.5 1-对甲苯磺酰基-2-乙氧羰酰基-4--7-N-杂 吲哚的合成 (5)

将2-乙氧羰酰基-4-溴-7-N-杂吲哚 (134 mg,0.5 mmol) 溶于10 mL二氯甲烷中,搅拌加热至40 ℃,化合物完全溶解,加入DMAP (183 mg,1.5 mmol) 和三乙胺 (0.216 mL,1.5 mmol),在40 ℃下缓慢滴加对甲苯磺酰氯 (285 mg,1.5 mmol) 的二氯甲烷溶液5 mL,滴毕维持40 ℃反应,次日停止反应。加入二氯甲烷30 mL,用饱和氯化钠溶液 (20 mL×3) 洗,无水硫酸镁干燥,浓缩,柱色谱纯化 (V乙酸乙酯V石油醚 = 1∶30) 得到白色固体120 mg,收率65%。mp 105~107 ℃; 1H NMR (400 MHz,acetone-d6) δ8.35 (d,J = 5.2 Hz,1H),8.26 (d,J = 8.0 Hz,2H),7.60 (d,J = 5.2 Hz,1H),7.48 (d,J = 8.0 Hz,2H),7.11 (s,1H),4.46 (q,J = 7.2 Hz,2H),2.42 (s,3H),1.42 (t,J = 7.2 Hz,3H)。

1.6 1-对甲苯磺酰基-2-乙氧羰酰基-4-氰基-7-N- 杂吲哚的合成 (6)

将1-对甲苯磺酰基-2-乙氧羰酰基-4-溴-7-N-杂吲哚 (211 mg,0.5 mmol) 溶于8 mL N,N-二甲基甲酰胺中,分别加入锌粉 (16 mg,0.25 mmol)、Zn(CN)2 (40 mg,0.35 mmol)、Pd(PPh3)4 (115 mg,0.1 mmol) 和dppf (83 mg,0.15 mmol),加热至 60 ℃反应30 min后停止反应,冷却至室温,倒入水中,用乙酸乙酯 (20 mL×3) 萃取,合并有机层,用饱和氯化钠溶液 (20 mL×3) 洗,无水硫酸镁干燥,浓缩,柱色谱纯化 (V乙酸乙酯V石油醚 = 1∶20) 得到白色固体130 mg,收率70%。mp 136~138 ℃; 1H NMR (400 MHz,acetone-d6) δ8.72 (d,J = 4.8 Hz,1H),8.28 (d,J = 8.0 Hz,2H),7.80 (d,J = 4.8 Hz,1H),7.52 (d,J = 8.0 Hz,2H),7.32 (s,1H),4.51 (q,J = 7.2 Hz,2H),2.45 (s,3H),1.45 (t,J = 7.2 Hz,3H); HR-MS (ESI): m/z,calcd. for C18H16O4N3S [M+H]+ 370.085 6,Found: 370.085 6。

1.7 2-羧基-4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚的合成 (7)

将1-对甲苯磺酰基-2-乙氧羰酰基-4-氰基-7-N-杂吲哚 (130 mg,0.35 mmol) 溶于2.5 mL二甲基亚砜中,将氢氧化钠 (70 mg,1.76 mmol) 和双氧水 (0.25 mL) 加入反应瓶中,加热至30 ℃左右,3 h后停止反应。加入水20 mL,用稀盐酸调pH值至4左右,抽滤,滤饼水洗,得到土黄色固体50 mg,收率69%。mp > 300 ℃; 1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ 13.25 (brs,1H),12.52 (s,1H),8.47 (d,J = 4.8 Hz,1H),8.14 (s,1H),7.67 (s,1H),7.47 (d,J = 4.8 Hz,1H),7.42 (s,1H); HR-MS (ESI): m/z,calcd. for C9H6O3N3 [M-H]-: 204.040 3,Found: 204.040 0。

1.8 4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚类化合物的合成 (8a8n)

以化合物8a为例: 将化合物7 (100 mg,0.488 mmol) 溶于5 mL N,N-二甲基甲酰胺中,加入EDC (234 mg,1.22 mmol)、HOBt (161 mg,1.22 mmol)、三乙胺 (0.211 mL,1.46 mmol) 和 (R)-3-氨基-1-Boc四氢吡咯 (227 mg,1.22 mmol),室温搅拌2天后停止反应。浓缩,加入乙酸乙酯和甲醇的混合溶液100 mL (V乙酸乙酯V甲醇 = 10∶1),依次用饱和碳酸氢钠溶液 (35 mL×2)、饱和氯化钠溶液 (35 mL×2) 洗,无水硫酸镁干燥,浓缩,柱色谱纯化得白色固体80 mg。化合物8b8n的合成同8a

1.9 4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚类化合物的合成 (9a9g)

以化合物9a为例: 将化合物8a (50 mg,0.134 mmol) 溶于3 mL二氯甲烷中,加入三氟乙酸 (0.195 mL,2.68 mmol) 于室温搅拌反应,次日停止反应。浓缩,加入水4 mL,用饱和碳酸氢钠溶液调至pH 8左右,浓缩,柱色谱纯化得白色固体12 mg。化合物9b9g的合成同9a

1.10 4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚三环类化合物的合成(10)

将化合物8n(37 mg,0.139 mmol) 溶于10 mL四氢呋喃中,于35 ℃分批加入氢化钠 (22 mg,0.558 mmol),3 h后停止反应。加水淬灭反应,浓缩,加入乙酸乙酯和甲醇的混合溶液40 mL (V乙酸乙酯V甲醇 = 10∶1),依次用饱和碳酸氢钠溶液 (15 mL×2)、饱和氯化钠溶液 (15 mL×2) 洗,无水硫酸镁干燥,浓缩,柱色谱纯化 (V二氯甲烷V甲醇 = 30∶1,V二氯甲烷V甲醇 = 25∶1) 得白色固体11 mg,收率35%; 熔点 > 300 ℃; 1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ12.52 (s,1H),8.41 (d,J = 4.8 Hz,1H),8.10 (brs,1H),7.63 (brs,1H),7.45 (d,J = 4.8 Hz,1H),7.27 (s,1H),4.42 (t,J = 9.3 Hz,2H),4.01 (t,J = 9.6 Hz,2H); HR-MS (ESI): m/z,calcd. for C11H11O2N4 [M+H]+ 231.087 6,Found: 231.087 2。

1.11 4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚三环类衍生物的合成(11a,11b)

以化合物11a为例: 将化合物10 (91 mg,0.395 mmol) 溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺中,加入碳酸铯 (514 mg,1.58 mmol) 和1-Boc-3-对甲苯磺酸酯四氢吡咯 (337 mg,0.989 mmoL),加热至60 ℃反应,次日停止反应。浓缩,加入乙酸乙酯和甲醇混合溶液80 mL (V乙酸乙酯V甲醇 = 10∶1),用饱和氯化钠溶液 (25 mL×2) 洗,无水硫酸镁干燥,浓缩,柱色谱纯化得白色固体95 mg。化合物11b的合成同11a

1.12 4-氨甲酰基-7-N-杂吲哚类衍生物的合成 (12a,12b)

以化合物12a为例: 将化合物11 (69 mg,0.173 mmol) 溶于5 mL二氯甲烷中,加入三氟乙酸 (0.25 mL,3.46 mmol),室温搅拌反应,次日停止反应。浓缩,加入水4 mL,用饱和碳酸氢钠溶液调至pH 8左右,浓缩,柱色谱纯化得淡黄色固体15 mg。化合物12b的合成同12a

2 PARP-1抑制活性评价

本文利用NAD+ 化学定量法评价化合物对PARP-1和PARP-2酶的抑制活性[26]。在96孔板中,设置 空白孔、NAD+ 对照孔、加酶对照孔和测试孔。空白孔加入测定缓冲液 (0.05 mol·L-1 Tris-HCl,pH 8.0,2 mmol·L-1 MgCl2) 35 μL、纯化缓冲液 (0.1 mol·L-1 NaCl,0.05 mol·L-1 Tris-HCl,pH 8.0,2 mmol·L-1 MgCl2,12% 甘油,临用前加入PMSF至终浓度为0.2 mmol·L-1) 10 μL、Sheared DNA 5 μL (75 μg·mL-1); NAD+对照孔加入NAD+ 30 μL (0.5 nmol)、纯化缓冲液10 μL、Sheared DNA 5 μL; 加酶对照孔NAD+ 30 μL (0.5 nmol)、PARP-1/2酶液10 μL (7 U)、Sheared DNA 5 μL; 测定孔加入NAD+ 30 μL (0.5 nmol)、PARP-1酶液10 μL (7 Units)、Sheared DNA 5 μL,另外加入5 μL的测 试化合物 (终浓度分别为100、50、25、10、5、2.5、1 μmol·L-1)。各孔补齐总体积50 μL,25 ℃反应1 h,然后加入用蒸馏水配制的2 mol·L-1浓度KOH 20 μL,用无水乙醇配制的20% 苯乙酮20 μL,4 ℃反应10 min,然后各孔加入90 μL甲酸,110 ℃反应5 min,冷却后,在360 nm激发光、445 nm发射光条件下测定荧光强度。计算各浓度测试化合物对PARP-1/2酶活性的抑制率和IC50

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