药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1800-1806   PDF    
环化小檗碱类似物的合成及其抗肿瘤活性研究
毕重文1, 张彩霞1, 李阳彪1, 赵午莉1, 邵荣光1, 梅林2     , 宋丹青1     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050;
2. 青岛市市立医院, 山东 青岛 266011
摘要:本研究设计合成了一组全新结构骨架的环化小檗碱(CBBR)类衍生物并对其抗肿瘤活性进行了评价,其中化合物6c6e6g对人肝癌HepG2细胞表现出较强的抗肿瘤活性,IC50值分别为176、123和91 nmol·L-1。尤其对阿霉素耐药的人乳腺癌MCF-7细胞也显示较好的抑制作用。初步作用机制显示,化合物6g阻滞肝癌HepG2细胞周期于G2/M期;在0.1 mg·mL-1时对DNA拓扑异构酶I(Top I)显示较强的抑制活性。研究结果为将此类化合物发展成一类新型抗肿瘤化合物奠定基础。
关键词环化小檗碱     抗肿瘤     构效关系     耐药     拓扑异构酶    
Synthesis and structure-activity relationship of cycloberberine as anti-cancer agent
BI Chong-wen1, ZHANG Cai-xia1, LI Yang-biao1, ZHAO Wu-li1, SHAO Rong-guang1, MEI Lin2     , SONG Dan-qing1     
1. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
2. Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China
Abstract: A series of cycloberberine derivatives were designed, synthesized and evaluated for their anti-cancer activities in vitro. Among these analogs, compounds 6c, 6e and 6g showed strong inhibition on human HepG2 cells. They afforded a potent effect against DOX-resistant MCF-7 breast cells as well. The primary mechanism showed that cell cycle was blocked at G2/M phase of HepG2 cells treated with 6g using flow cytometry assay. It significantly inhibited the activity of DNA Top I at the concentration of 0.1 mg·mL-1. Our results provided a basis for the development of this kind of compounds as novel anti-cancer agents.
Key words: cycloberberine     anti-cancer     structure-activity relationship     drug-resistance     topoisomerase    

本课题组在长期开展小檗碱 (BBR,图 1) 衍生物的结构修饰及新生物活性寻找中[1, 2, 3, 4, 5],为了获得抗肿瘤活性增强的化合物,在BBR结构中的1-和13-位骈合一个芳香E环,构建了一类全新结构骨架的化合物——环化小檗碱 (CBBR,图 1),以增加其平面结构,使其更容易嵌入到DNA双链碱基对中,进而增加其抗肿瘤活性,由此发现了一类全新结构骨架的CBBR类化 合物。进一步研究表明,此类化合物的抗肿瘤活性大大强于BBR,是一类新型DNA Top I/II双重抑制剂[6]

Figure 1 Structures of berberine and cycloberberine

本研究在上述工作基础上,仍以CBBR为先导化合物,针对分子中的多个结构片段,如A环2-和3-位 的亚甲二氧基、C环8-位以及D环9-位,继续开展较为系统的结构修饰与优化,进一步丰富此类化合物的抗肿瘤构效关系,为此类化合物发展成一类新型抗肿瘤化合物奠定基础。

本文共设计合成了23个全新结构的CBBR类似物(合成路线如路线1所示),通过其体外抗肿瘤活性的评价,总结了此类化合物的抗肿瘤构效关系,并对其作用机制进行了初步探讨。

Scheme 1 Reagents and conditions: (a) NaBH4 in 5% NaOH,K2CO3; (b) CHOCHO in CH3COOH,reflux; (c) 2% HCl; (d) 30-40 mmHg,195-210 ℃; (e) Acyl chloride or benzyl chloride; (f) m-Trihydroxybenzene in 60% H2SO4; (g) 4-Fluorobenzoyl chloride; (h) CH3I; (i) NaBH4,75-80 ℃; (j) 20% KOH,reflux
结果与讨论 1 化学合成部分

以BBR为起始原料,经过还原[7]、取代、环化 等3步反应,得到关键中间体CBBR,其中环化反应是整个反应过程的关键步骤,此步反应中,将2% 的HCl溶液加入到中间体13-乙醛BBR (4) 中,室温搅拌1 h后过滤及时除去未反应的BBR,然后室温搅拌5天,重结晶即可得到CBBR。CBBR在高温减压条 件下选择性去甲基反应获得中间体9-去甲基CBBR (5),其与不同结构的酰氯和对硝基氯苄进行卤代反应,即可得目标化合物6a6q。将CBBR与均苯三酚在60% H2SO4中加热,亚甲二氧环开环生成化合物7,裸露的羟基进一步醚化和酯化可得化合物8a8b9。将CBBR用硼氢化钠选择性还原后可得到化合物10,强碱处理后可得到CBBR的碱式酮基产物11。衍生物的结构经1H NMR以及HR-ESI-MS分析确证。目标化合物的结构、收率、理化参数和波谱数据见表 1、2。

Table 1 Structures and physical properties of target compounds

Table 2 Spectra data of target compounds
2 抗肿瘤活性评价

采用磺酰罗丹明B染色法(SRB),以拓扑替康 (TPT) 为阳性对照药,测定出化合物抑制人肝癌HepG2细胞的活性实验结果见图 2

Figure 2 Inhibitory activity of newly synthesized compounds on human HepG2 cells. IC50: Drug concentration required to inhibit human tumor cells proliferation by 50% after 48 h treatment

构效关系总结如下: ① 将CBBR的A环打开后 2-和3-位羟基引入对氟苯甲酰基,活性大幅减弱,而引入甲基后活性保持或略有提高,提示A环亚甲二氧基可能使整体分子保持较高的平面性更易嵌入DNA螺旋分子中[8, 9]; ② 将CBBR的D环9-位脱甲基后,对其生成的羟基进行酰化和醚化生成化合物6a6q,其中醚化产物6q和磺酰化产物6p活性大幅减弱,而芳香甲酰化产物活性普遍较好,同时芳香环上取代基的种类、数量、位置的变化对于抗肿瘤活性亦有影响; ③ CBBR C环8-位结构改造后生成的二氢化CBBR产物10和酮基产物11在0.6 μg·mL-1浓度下对人肝癌HepG2细胞抑制率分别为19.3% 和12.6% ,活性大幅减弱,可能由于结构中的季铵正离子的消失,使其活性降低。在所合成的化合物中,6c6e6g显示出良好的体外抗肿瘤活性,值得进一步研究。

进一步研究显示,化合物6c6e6g对阿霉素 (DOX) 耐药的乳腺癌MCF-7细胞的作用,结果如表 3,以DOX为阳性对照药,与DOX相比,化合物6c6e6g仍具有较好的活性。说明此类化合物可改善日趋严重的耐药性问题。

Table 3 Inhibitory activity of active compounds on drug-resistant cells (IC50,μg·mL-1). aMCF-7/DOX: Human MCF-7 breast cancer cells which have developed resistance to doxorubicin (DOX)
3 初步机制研究

为了探讨此类化合物的抗肿瘤作用机制,选择活性较好的化合物6g检测其作用于HepG2细胞的细胞周期变化,结果如图 3,经化合物6g (1 μg·mL-1) 处理24 h后,使用流式细胞仪分析,发现细胞明显出现G2/M期的堆积。进一步测定了化合物6c6g对于DNA拓扑异构酶I (DNA Top I) 的作用,以TPT为阳性对照药,结果如图 4,结果显示化合物6c6g在0.1 mg·mL-1时对DNA Top I有较强的抑制解螺旋作用,这可能由于其具有良好的平面结构,从而更容易嵌入DNA Top I及其DNA复合物。

Figure 3 Blockade of cell cycle at G2/M phase of HepG2 cells treated with 6g

Figure 4 Inhibitory activity of compounds 6g and 6c on DNA Top I
小结

本研究设计合成了23个未见文献报道的CBBR 衍生物,并对体外抗肿瘤活性进行了评价。构效关系表明: A环的亚甲二氧基和C环季铵正离子是活性 必需基团; D环9-位脱甲基后,引入芳香甲酰基使活性大大提高。此类化合物将HepG2细胞周期阻滞于G2/M期,对DNA Top I有一定的抑制解螺旋作用。尤为重要的是,该类化合物对DOX耐药的MCF-7细胞亦有效,可能由于还作用于另外的作用靶点,如DNA Top II[6]的缘故。但此类化合物的平面刚性结构致使其溶解度大为降低,可以通过制备前药的手段加以缓解,这部分工作本实验室正在进行中。结果表明CBBR是一类抗肿瘤活性强的化合物,拥有对耐药肿瘤细胞有效的优势。

实验部分

化合物熔点用CXM-300熔点仪测定,温度未经校正; 1H NMR用Varian Inova 400核磁共振仪测定,TMS为内标; HR-MS用Autospec Ultima-TOF质谱仪测定; 化合物纯化使用TELEDYNE快速柱色谱; 薄层色谱使用Merck GF254制备成品板; 紫外分析仪为ZF-C型三用紫外分析仪; 所用试剂均为分析纯。

1 化学合成 1.1 2,3-亚甲氧基-9,10-二甲氧基环化原小檗碱氯化物 (2) 的合成

将溶有硼氢化钠(1.2 g,32 mmol) 的5% 氢氧化钠溶液10 mL逐滴加入至含1 (7.4 g,20 mmol) 和碳酸钾 (8.3 g,60 mmol) 的250 mL甲醇溶液体系中,室温搅拌2 h,抽滤收集析出的黄绿色固体,滤饼依次

用蒸馏水(100 mL) 和80% 乙醇 (100 mL) 洗涤,得到二氢小檗碱 (3) 4.2 g。将中间体二氢小檗碱 (4.0 g,12 mmol) 溶解在160 mL乙腈中,然后加入40 mL乙酸和2 mL 40% 的乙二醛,加热至85~95 ℃回流5 h,TLC监测反应完全,将反应液浓缩,得到深红色油状物4,加入2% 盐酸溶液200 mL,室温搅拌1 h,过滤,滤液室温搅拌5天,将反应液浓缩,用95% 乙醇重结晶,所得产物用乙醚洗涤,得橙色固体1.8 g。

1.2 中间体2,3-亚甲氧基-9-羟基-10-甲氧基环化原小檗碱氯化物 (5) 的合成

2 (3.6 g,9.1 mmol) 置于250 mL圆底烧瓶中,保持真空度为30~40 mmHg,加热至195~210 ℃反应30 min,固体颜色逐渐加深,最后全部变为深红色,盐酸乙醇 (5 mL/95 mL) 酸化得到红色固体3.2 g。

1.3 D环9-位取代衍生物6a6q的合成 1.3.1 2,3-亚甲氧基-9-邻甲氧基苯甲酰氧基-10-甲氧基环化原小檗碱氯化物 (6a)

将邻甲氧基苯甲酸 (162 mg,1.04 mmol) 加入至5 mL二氯亚砜中,回流2 h,减压蒸馏除去多余溶剂二氯亚砜。将5 (99 mg,0.26 mmol) 混悬于5 mL干燥乙腈中,升温至回流基本溶解,加无水吡啶 (84 μL,1.04 mmol),然后加入上述酰氯,继续回流6 h,TLC监测反应完全。充分冷却,抽滤收集析出的固体,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,得到红色固体30 mg。

化合物6b6p的合成方法同6a

1.3.2 2,3-亚甲氧基-9-对硝基苄氧基-10-甲氧基环化原小檗碱氯化物 (6q)

5 (99 mg,0.26 mmol) 溶于5 mL DMF,然后加入研细的氢氧化钾 (30 mg,0.52 mmol) 和对硝基氯苄 (134 μL,1.04 mmol),加热至60 ℃反应12 h,减压浓缩除去溶剂,残余物用稀盐酸调pH至3,抽滤收集析出的固体,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,得到紫色固体 72 mg。

1.4 A2,3-位取代衍生物78a8b9的合成 1.4.1 2,3-二羟基-9,10-二甲氧基环化原小檗碱氯化物 (7)

90 ℃下将间苯三酚 (3.0 g,18.5 mmol) 分批多次加入至60 mL 60% 硫酸 (v/v) 直至形成无色澄清溶液,然后分批加入2 (3.0 g,7.6 mmol) 形成深红色混悬液,90 ℃继续反应10 h,TLC检测反应完全。剧烈搅拌下,将反应液趁热倾至50 mL饱和食盐水中,室温搅拌2 h,然后放入 -20 ℃冰箱充分冷却。抽滤,将固体用蒸馏水洗涤,并将其溶于1 mol·L-1 NaOH (100 mL),随后用2 mol·L-1盐酸100 mL调至酸性,充分搅拌,抽滤收集析出的固体,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,所得固体用盐酸乙醇 (5 mL/95 mL) 重结晶,得到红色固体1.8 g。

1.4.2 2,3-二 (对氟苯甲酰氧基)-9,10-二甲氧基环化原小檗碱氯化物 (8a)

7 (99 mg,0.26 mmol) 混悬于5 mL干燥乙腈中,升温至回流基本溶解,加入无水吡啶 (84 μL,1.04 mmol),然后加入对氟苯甲酰氯 (185 μL,1.56 mmol),继续回流6 h,TLC监测反应完全。充分冷却,抽滤收集析出的固体,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,得到橙红色固体18 mg。

1.4.3 2,3-二甲氧基-9,10-二甲氧基环化原小檗碱氯化物 (8b)

7 (0.99 g,2.6 mmol) 溶于50 mL DMF,然后加入研细的氢氧化钾 (300 mg,5.2 mmol) 和碘甲烷 (640 μL,10.4 mmol),加热至60 ℃反应12 h,减压浓缩除去溶剂,残余物用稀盐酸调pH至3,抽滤收集析出的固体,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,得到红色固体0.57 g。

1.4.4 2,3-二甲氧基-9-羟基-10-甲氧基环化原小檗碱氯化物 (9)

8b (200 mg,0.62 mmol) 置于250 mL圆底烧瓶中,保持真空度为30~40 mmHg,加热至195~210 ℃反应30 min,固体颜色逐渐加深,最后全部变为深红色,以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,盐酸乙醇 (5 mL/95 mL) 酸化得到红色固体174 mg。

1.5 C环8-位取代衍生物1011的合成 1.5.1 2,3-亚甲二氧基-9,10-二甲氧基二氢环化原小檗碱 (10)

75~80 ℃下,将硼氢化钠 (0.11 g,3 mmol) 分批加至含CBBR (0.79 g,2 mmol) 和碳酸钾 (0.83 g,6 mmol) 的95%甲醇 (20 mL) 中,保持此温度搅拌20 min,然后室温继续搅拌4 h,再分批加入硼氢化钠 (0.38 g,10 mmol),室温搅拌10 min后抽滤,95% 甲醇洗涤滤饼,得到黄色固体0.70 g。

1.5.2 2,3-亚甲二氧基-8-酮基-9,10-二甲氧基二氢环化原小檗碱 (11)

将CBBR (396 mg,1.0 mmol) 溶解在10 mL 20% 氢氧化钾水溶液中,回流12 h,反应液减压浓缩,过滤,滤液浓缩后以二氯甲烷/甲醇为流动相,用快速柱分离纯化,得到黄绿色固体100 mg。

2 生物活性评价 2.1 体外IC50的测定

在96孔板上以4×103的密度接种人肝癌HepG2细胞,采用6 μg·mL-1的浓度初筛化合物。 48 h后,细胞用50% 三氯乙酸 (TCA) 固定,并用SRB (0.4%) 稀醋酸溶液染色。室温静置10 min,未与细胞结合的SRB用1% 稀醋酸溶液洗5遍,空气干燥。 结合的SRB用10 mmol·L-1非缓冲Tris碱液 (pH 10.5) 振荡溶 解,酶标仪测定各孔光吸收,测定波长为492 nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率。计算公式为抑制率 (%) = (1 - 化合物OD492 / 对照OD492) × 100。对肝癌细胞HepG2采用6、1.5、0.75、0.375和0.187 5 μg·mL-1的药物浓度,对DOX耐药的MCF-7细胞采用8、4、2、1和0.5 μg·mL-1的药物浓度进行增殖抑制实验。

2.2 流式细胞仪测定

用1μg·mL-16g处理HepG2细胞,分别在4、8、12和24 h收集药物处理后的细胞,PBS洗两次,加入预冷的75% 乙醇,-20 ℃固定过夜,离心除去乙醇,PBS洗两次,加入200 mg·mL-1 RNA酶37 ℃消化30 min,加碘化吡啶2.5 mg·mL-1,4 ℃避光染色 30 min后,流式细胞仪检测细胞周期变化。

2.3 DNA Top I抑制试验

将一单位DNA Top I和不同浓度的药物在37 ℃反应20 min,再加入0.5 μg Pbr322 DNA在37 ℃继续反应30 min,加入0.5%的SDS、0.25 μg·μL-1的溴酚兰和15% 的甘油终止反应。在TBE电泳缓冲液中进行琼脂糖电泳,40 V电压下电泳4 h。溴化乙啶溶液染色30 min,置于紫外线下观察DNA的电泳区带,并摄片记录。

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