药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1807-1811   PDF    
微量量热法研究中药黄连6种生物碱之间相互作用关系
李俊贤1,2, 王嘉毅1,3, 张乐乐1, 鄢丹1     , 王睿林1, 李宝才2, 肖小河1     
1. 解放军第302医院全军中药研究所, 北京 100039;
2. 昆明理工大学生命科学与技术学院, 云南 昆明 650093;
3. 江西中医药大学药学院, 江西 南昌 330004
摘要:本文采用微量量热法研究黄连6种生物碱对痢疾杆菌生长代谢的影响,比较各生物碱在黄连抑菌效果中所占的贡献度,确定主要的药效物质,并围绕其展开与其他生物碱之间相互作用关系的研究。结果表明,0.8 mg·mL-1黄连水提液中,各生物碱的贡献度分别是:药根碱和非洲防己碱3.21%,表小檗碱2.49%,巴马汀4.27%,黄连碱36.31%,小檗碱52.83%,由此判断小檗碱与黄连碱为主要的抑菌活性物质。各成分相互作用关系显示,黄连中存在与抑菌活性相拮抗的物质;小檗碱与黄连碱之间存在协同作用;其他4种生物碱与小檗碱和黄连碱存在叠加作用。该结论为中药黄连质量标准的制定和新的组分中药的研制提供了参考。
关键词微量量热法     药效物质     黄连     痢疾杆菌     药物相互作用    
Microcalorimetric investigation on the interaction of six alkaloids from Rhizoma Coptidis
LI Jun-xian1,2, WANG Jia-yi1,3, ZHANG Le-le1, YAN Dan1     , WANG Rui-lin1, LI Bao-cai2, XIAO Xiao-he1     
1. Military Institute of Chinese Materia Medica, 302th Military Hospital of China, Beijing 100039, China;
2. College of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650093, China;
3. College of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
Abstract: How to identify active constituents of traditional Chinese medicines (TCMs) and study their interactions are key problems in the development of TCMs. The inhibitory effect of six alkaloids from Rhizoma Coptidis (RC) on Shigella dysenteriae (S. dysenteria) growth had been investigated by microcalorimetry in this study. Main active constituents of RC were confirmed by comparing their contributions to the bacteriostatic effect, and the interactions among active constituents were further researched. According to the result, in 0.8 mg·mL-1 extract of RC, the contributions of six active alkaloids including berberine, coptisine, epiberberine, palmatine and the combination of jatrorrhizine and columbamine were 52.83%, 36.31%, 2.49%, 4.27% and 3.21%, respectively. Therefore, berberine and coptisine were the main active constituents of RC that inhibited the growth of S. dysenteria. The study of interactions among the six alkaloids indicated that, ① there were some constituents antagonizing the inhibitory effect of RC, ② there was a synergy effect between berberine and coptisine, ③ there were additive effects between other four alkaloids and the main active constituents. These results may provide some useful references for the establishment of the quality standard for RC and the development of multi-component TCMs.
Key words: microcalorimetry     active constituent     Rhizoma coptidis     Shigella dysenteriae     drug interaction    

药物相互作用(drug interaction,DI) 是指两种及其以上的药物同时使用时所产生的药物作用或药效变化。药物的相互作用研究对于提高医疗质量、安全合理的用药极为重要。中药药效物质的辨识,及各种药物成分之间相互作用研究一直是中医药研究的重点,也是影响中医药现代化发展的关键问题[1, 2]。由于中药自身的复杂性、疗效的多样性,因此,本文应用组分中药[3, 4]的思想将中药主要的有效部位、组分或成分相互组合,进行组合对比和疗效分析,找出拮抗性成分、协同性成分,为中药的药效物质辨识及其相互作用研究提供有力的参考。

黄连(Rhizoma Coptidis) 为临床常用中药,具有清热燥湿、泻火解毒、治痈肿疖疮、目赤牙痛之功效[5, 6]。现代研究发现,黄连中主要的药效物质为生物碱部分,主要是小檗碱(berberine,Ber),其次为黄连碱 (coptisine,Cop)、巴马汀 (palmatine,Pal)、表小檗碱 (epiberberine,Epi)、药根碱 (jatrorrhizine,Jat)、非洲防己碱 (columbamine,Col),6种生物碱量占总生物碱量的95% 以上[7, 8]。该类生物碱为黄连及其制剂的主要活性成分,其含量被作为评价指标进行质量控制[9],但在现代众多研究中,从未确定该6种生物碱在黄连的抑菌活性中所占的具体比重,且关于6种生物碱之间的相关作用的研究也未有报道。

在本研究中,采用微量量热法评价了6种生物碱对痢疾杆菌生长代谢的影响,以相对抑菌率Ik为指标[10],对其抑菌活性进行客观地量化评价,找出各生物碱在黄连抑菌效果中所占的贡献度,从而找出黄连药材中主要的药效物质; 并考察主要药效物质与其他生物碱之间的相互作用关系。

材料与方法 仪器

高效液相色谱仪 (Agilent Technologies 1200,美国); 微量分析天平(Mettler Toledo AL204,瑞士); Thermometric 3114 TAM Air微量量热仪(Thermometric AB,Sweden)。

实验材料

痢疾杆菌 (Shigella dysenteriae,CMCC B 51252) 第4代,由中国食品药品检定研究院提供。对照品小檗碱 (Ber)、黄连碱 (Cop)、表小檗碱 (Epi)、巴马汀 (Pal)、药根碱 (Jat)、非洲防己碱 (Col) 均由中国食品药品检定研究院提供 (纯度大于99.8%)。药材黄连购于四川,经中国人民解放军302医院中药研究所肖小河研究员鉴定为味连 (Coptis chinensis Franch.)。乙腈、甲醇 (色谱纯,Fisher公司,美国),其他试剂均为分析纯,水为去离子水。Luria- Bertani (LB) 培养基 (取酵母膏2.5 g、NaCl 12.5 g、蛋白胨5 g,溶解于去离子水500 mL中,调pH 7.0~7.2后,121 ℃高压蒸气灭菌30 min,完全冷却后置 4 ℃保存备用) 。

化学分析

混合对照品溶液的制备: 精密称取药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱对照品适量,加甲醇制成对照品溶液。

供试品溶液的制备: 分别称取黄连药材3份,每份50 g,以8倍量水煎煮2次,每次1.5 h,趁热过滤,合并滤液,减压浓缩、干燥,得干粉备用。

黄连水提物分析样品制备: 精密称定黄连水提物粉末50 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解,用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱 (250 mm × 4.6 mm,8 mm),以乙腈0.05 mol·L-1,磷酸二氢钾溶液 (50∶50) (每100 mL中加十二烷基硫酸钠 0.4 g,再以磷酸调至pH 4.0); 流速1.0 mL·min-1,检测波长345 nm,柱温30 ℃[9],理论塔板数按小檗碱计算大于5 000。

抑菌活性检测

精密称取药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱对照品适量,分别配制实验所需要的各浓度生物碱样品溶液。

采用安瓿法,在无菌条件下,向各安瓿瓶中精确加入接种了痢疾杆菌的LB培养基5 mL,接种量为2×106 CFU·mL-1,然后加入各样品药液5 mL,加盖瓶塞,密封,放入微量量热仪中,通过仪器自带的软件工具跟踪记录痢疾杆菌生长代谢功率-时间 (P-t)曲线。控温于37 ℃,当曲线返回基线时,结束实验。

结果 1 黄连水提物含量测定

黄连水提液中各生物碱的百分含量: 小檗碱15.59%,黄连碱5.28%,表小檗碱3.76%,巴马汀3.80%,非洲防己碱+药根碱的含量以小檗碱计为2.04%。色谱图见图 1

Figure 1 HPLC chromatograms of methanol (A),alkaloid standard solutions (B),0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis (C). 1: Columbamine (Col); 2: Jatrorrhizine (Jat); 3: Epiberberine (Epi); 4: Coptisine (Cop); 5: Palmatine (Pal); 6: Berberine (Ber)
2 热力学参数的提取及抑制率的计算

在恒温37 ℃条件下,痢疾杆菌在LB培养基中的生长代谢的热谱曲线见图 2A。由此热谱曲线可看出,痢疾杆菌的生长代谢过程可分为3个阶段: 阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及4个时期: 第一指数生长期 (A-B)、停滞期 (B-C)、第二指数生长期 (C-D) 和衰亡期 (D-E)[11, 12]

Figure 2 Power-time (P-t) curves of Shigella dysenteriae (S. dysenteriae) monitored by the microcalorimeter at 37 ℃. A: P-t curves of S. dysenteriae cultured in Luria Bertani (LB) medium; B: P-t curves of S. dysenteriaecultured in LB medium (control),0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis and the six alkaloids. The concentrations of Col,Jat,Epi,Cop,Pal and Ber were determined according to their contents in 0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis

在第Ⅰ阶段,安瓿瓶刚刚放入仪器中,瓶内温度未达到37 ℃,安瓿瓶进行吸热升温,细菌未有明显生长。当温度达到37 ℃时,痢疾杆菌最先利用安瓿瓶中的有限氧气进行有氧呼吸的生长代谢,此阶段称为第Ⅱ阶段,细菌生长过程伴随着热量的大量产出,即出现了细菌生长过程的第1个产热高峰。当细菌的有氧呼吸将瓶中有限氧气耗尽时,开始利用LB培养基进行无氧发酵代谢,当LB培养基被耗尽时,细菌进入静息衰退期直至死亡。此阶段称为细菌生长的第Ⅲ阶段,伴随着细菌的无氧发酵,细菌的产热 也会出现第2个产热高峰。

通过仪器记录的痢疾杆菌生长的热谱曲线,得到一个关于指数增长期的lnPtt的线性方程、痢疾杆菌在第一阶段和第二阶段生长速率常数k1k2等热力学参数[13]

式1中Pt为时间 t 时的产热功率,P0为零时的产热功率。细菌生长的最大产热功率用P1P2表示,达峰时间记为t1t2,该曲线下的总的峰面积为细菌的总放热量 (Qt)。

根据文献[10, 14]报道,多以生长速率常数k为指标进行抑制率I的计算,由于第一指数阶段生长速率常数k1变化不明显,故采用第二指数阶段生长速率常数k2计算。

式2中k0为空白样品中痢疾杆菌的生长速率常数,k2为黄连及其不同成分溶液作用下痢疾杆菌的第二指数阶段生长速率常数。

3 6种生物碱作用下痢疾杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱

图 2B为在37 ℃时,通过安瓿法测定的黄连水提液 (0.8 mg·mL-1) 及6种生物碱 (浓度相当于0.8 mg·mL-1黄连水提液中的含量浓度) 作用下痢疾杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱,即产热P-t曲线。从图中可以看出,当不同生物碱样品加入安瓿瓶中之后,细菌生长代谢的B-C段、D-E段、两个最高峰的峰高及出峰时间发生了变化,表明细菌的生长代谢受到了影响,具体表现为达峰时间t均有明显的延长,生长速率常数k也随之降低。

根据6种生物碱及黄连水提液作用下痢疾杆菌生长代谢热力学参数中的生长速率常数k2,计算各样品对痢疾杆菌生长的抑制率I,以黄连水提液 (0.8 mg·mL-1) 的抑菌率为标准,计算6种生物碱对黄连整体抑菌效果的贡献度C

式3中Iw为黄连水提液 (0.8 mg·mL -1) 对痢疾杆菌的抑制率,Ix为各生物碱单体 (浓度相当于0.8 mg·mL-1黄连水提液中的含量浓度) 对痢疾杆菌的抑制率。计算得到6种生物碱对整体抑菌效果的贡献度如下: Ber为52.83%,Cop为36.31%,Pal为4.27%,Col+Jat为3.21%,Epi为2.49%。由上可以确定小檗碱与黄连碱为黄连药材中主要的抑菌活性物质,在6种生物碱之间的相互作用关系的考察中,可重点对这两种生物碱进行考察。

4 6种生物碱之间的相互作用关系的考察

黄连是由生物碱部分、多糖、氨基酸等多成分组成的复杂体系,其组分之间存在一定的相互作用 (协同、拮抗) 关系。这种关系的发现,可为黄连药效物质辨识提供参考。图 3为在37 ℃时参照黄连水提液中各生物碱含量,配制的实验所需要的各生物碱样品 (每毫升溶液相当于0.8 mg黄连水提液) 作用下痢疾杆菌生长代谢的生物热活性指纹图谱 (产热P-t曲线)。

Figure 3 Power-time (P-t) curves of S. dysenteriae growth monitored by the microcalorimeter at 37 ℃. The concentrations of Col,Jat,Epi,Cop,Pal and Ber were determined according totheir contents in 0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis

图 3中可发现,含有黄连碱、小檗碱及两者组合的样品溶液对细菌的生长代谢存在明显的抑制作用; 而不含有此两种生物碱的样品溶液,对细菌的生长代谢虽存在一定的抑制作用,但效果不显著。通过对其他生物碱与 (Ber+Cop) 配比的抑菌效果的考察可发现,黄连水提液与只含生物碱的溶液相比,抑菌效果稍弱; 而 (Ber+Cop) 样品的抑菌效果与其配比其他生物碱后的样品溶液只存在微小差异。

为使多次实验整齐可比,结合各生物碱单体的抑菌实验,以固定浓度药材 (0.8 mg·mL-1) 的抑菌率为标准,求得各样品的相对抑菌率Ik,并作出各生物碱单独使用与联合应用时对痢疾杆菌的相对抑制率的影响,如图 4。通过整体与各成分单独使用样品对痢疾杆菌相对抑制率之和相比较,初步探索和阐明各成分之间的相互作用关系。结果表明,Ber、Cop与Ber+Cop之间及黄连药材水提液与生物碱部分之间抑菌作用有明显的差异。可见,小檗碱与黄连碱之间存在明显的协同作用; 其他4种生物碱与小檗碱和黄连碱存在叠加作用; 而通过比较生物碱部分与黄连药材水提液的抑菌效果,发现6种生物碱的抑菌活性明显高于黄连水提液整体的抑菌活性。由此提示,在黄连整体水提液中,可能存在有与生物碱抑菌活性相互拮抗的物质。

Figure 4 Relative inhibition rate Ik (%) of the six alkaloids on S. dysenteriae. The Ik of 0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis was defined 100%. The concentrations of Col,Jat,Epi,Cop,Pal and Ber were determined according to their contents in 0.8 mg·mL-1 extract of Rhizoma Coptidis. **P < 0.01
讨论

本研究借助于微量量热技术,在化学表征的基础上,对黄连中6种生物碱对痢疾杆菌生长代谢影响的全过程进行实时在线监测并分析,确定小檗碱与黄连碱为黄连药材中主要的抑菌活性物质。通过比 较各生物碱联合使用对痢疾杆菌相对抑制率与单独使用时相对抑制率之和,初步探讨各物质之间可能存在的相互作用关系,进一步研究发现: ① 比较黄连药材与6种生物碱部分的相对抑菌率可知,其他部分对6种生物碱部分的抑菌活性存在拮抗作用; ② 比 较6种生物碱之间的相互作用可知,小檗碱与黄连碱之间存在协同作用; 其他4种生物碱与小檗碱和黄连碱存在叠加作用。故在黄连药材中,抑制痢疾杆菌生长代谢的关键药效物质为黄连碱与小檗碱。本研究为中药黄连抑菌药效物质辨识、各成分的生物活性及其相互作用关系的研究提供了有力的参考,亦为其他组分中药的开发和研究提供了适宜的模式与方法学支持。

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