药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1812-1816   PDF    
电喷雾四极杆飞行时间质谱研究紫杉醇类药物的裂解规律
马文晓1, 王浩1, 王婷婷2, 杨艳1, 顾景凯1,2     
1. 吉林大学药物代谢研究中心, 吉林 长春 130012;
2. 吉林大学白求恩第一医院临床药理中心, 吉林 长春 130061
摘要:采用高质量准确度、高分辨率的Q-TOF研究了在电喷雾正离子模式下含有紫杉烷二萜基本骨架的两种紫杉醇类药物的质谱裂解行为。通过ESI-MS产生的[M+H]+ 获得相应化合物的相对分子质量信息,对[M+H]+ 进行碰撞诱导解离(collisional-induced dissociation,CID),以质子化准分子离子[M+H]+ 作为内标物,对碎片离子进行准确质量测定,确认这些碎片离子的元素组成,获得相应化合物的裂解途径信息。研究发现,结构类似的紫杉醇和多烯紫杉醇具有相似的电喷雾质谱行为,侧链与紫杉烷环连接处的C-O键易断裂,之后脱去二萜骨架上的取代基,并形成m/z 105.033 7、291.137 3、309.148 5、327.159 7、387.181 2和509.217 4等共同碎片,这些特征可为紫杉醇类药物的体内外定性和定量研究提供依据。
关键词紫杉醇     多烯紫杉醇     电喷雾/四级杆-飞行时间质谱     正离子模式    
Fragmentation behaviors of taxanes drugs using electrospray ionization with quadrupole time-of-flight mass spectrometry
MA Wen-xiao1, WANG Hao1, WANG Ting-ting2, YANG Yan1, GU Jing-kai1,2     
1. Research Center for Drug Metabolism, Jilin University, Changchun 130012, China;
2. The First Bethune Hospital of Jilin University, Changchun 130061, China
Abstract: The fragmentation pathways of two taxanes drugs have been studied in positive ion mode by Q-TOF with the advantages of high mass accuracy and high resolution analysis. The [M+H]+ ions were observed by ESI-MS, from which the molecular weights were obtained. Using the protonated pseudo-molecular ions [M+H]+ as internal reference compounds, the accurate mass and element composition of the fragment ions were determined. The collision induced dissociation (CID) data of the [M+H]+ ions provided fragmentation pathways of related compounds. Results showed that the major cleavage pathways of paclitaxel and docetaxel were the same that the cleavage of C-O bond between the side chain and taxol skeleton easily occurred, then stripping of the functional groups on the parent ring. Some common fragments were formed, such as m/z 105.033 7, 291.137 3, 309.148 5, 327.159 7, 387.181 2 and 509.217 4, which would provide a basis for future qualitative and quantitative analysis of taxanes in vitro and in vivo.
Key words: paclitaxel     docetaxel     electrospray ionization/quadrupole time-of-flight mass spectrometry     positive ion mode    

紫杉醇类药物主要包括紫杉醇和多烯紫杉醇 (图 1),是治疗某些常见恶性肿瘤的主要药物,其中紫杉醇是肺癌、卵巢癌和乳腺癌的一线治疗药物; 多烯紫杉醇主要用于非小细胞肺癌的一线治疗或铂类药物治疗失败后的二线治疗[1, 2, 3]。紫杉醇是从紫杉或红豆杉树中提取的二萜类化合物,而多烯紫杉醇则是由欧洲红豆杉叶中提取物10-deacetylbaccatin Ⅲ 经合成而来的半合成紫杉醇类似物[4, 5]。它们是复杂的酯类化合物,母核为紫杉烷二萜骨架,其中在C-4和C-5位上含有一个四元氧杂环。

Figure 1 The structures of paclitaxel and docetaxel

对于紫杉醇类化合物的生物质谱研究主要集中于原形药及其代谢物的定性和定量分析等方面[6, 7]。Abliz等[8, 9]利用单位质量分辨率的ESI-MS对紫杉醇的裂解规律进行了研究,但未对其产生的碎片离子进行准确的质量测定和归属。近年来,质谱技术的发展为化合物精细结构的解析提供了技术平台[10, 11]。本文采用具有高分辨率和高准确性的电喷雾/四极杆-飞行时间质谱 (ESI-Q-TOF/MS) 对紫杉醇和多烯紫杉醇的碎片离子进行准确的质量测定,确认了这些碎片离子的元素组成,总结了质谱裂解规律,为紫杉醇类化合物的体内外定性和定量研究提供了科学依据。

材料与方法 仪器与试剂

Agilent 1100 Series高效液相色谱系统,AB SCIEX Triple TOF 5600 (AB SCIEX公司,美国) ,PeakView 1.1软件。甲醇 (色谱纯) 购自英国Fisher Scientific公司,甲酸 (色谱纯) 购自美国TEDIA公司,水为Milli-Q水 (Millipore,Billerica,MA,美国)。紫杉醇 (编号Y0000698) 和多烯紫杉醇 (编号Y0001133) 购自Sigma-Aldrich (St. Louis,MO,USA)公司。

质谱分析条件

ESI电离源,正离子扫描,喷雾电压5 kV,碰撞电压为30 V,源温度450 ℃,雾化气20 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa),加热气30 psi,帘气25 psi,解簇电压20 V,离子质量扫描范围为m/z 50~950。将两种药物对照品的甲醇溶液用注射泵导入ESI离子源,注射泵进样速度: 20 μL·min-1

结果与讨论 1 紫杉醇和多烯紫杉醇在正离子模式下的质谱分析

在正离子电喷雾质谱中,紫杉醇和多烯紫杉醇一级全扫描质谱以[M+H]+准分子离子峰为基峰,质荷比分别为m/z 854.338 3和m/z 808.353 4,同时出现[M+Na]+和[M+NH4]+等加合离子峰。

2 紫杉醇和多烯紫杉醇二级质谱数据分析及裂解规律研究 2.1 紫杉醇二级质谱分析

紫杉醇测定的质量精度见表 1。Abliz等[8]对单位质量分辨率质谱获得的紫 杉醇二级质谱碎片中丰度高的m/z 776、m/z 569、m/z 551、m/z 509和m/z 286进行了归属,本文通过高分辨质谱获得二级质谱碎片并用PeakView 1.1软件进行分析,得到的结果与文献报道一致,同时本文还发现了一些新的碎片并对其进行了归属。

Table 1 Predicted ion structure,measured and calculated m/z value and mass errors of ESI-MS2 product ions obtained from the [M+H]+ of paclitaxel

图 2a图 3所示,当碰撞电压为15 eV时,紫杉醇 [M+H]+ 准分子离子峰脱去一分子H2O和乙 酸(AcOH) 形成m/z 776.305 6。m/z 776.305 6可进一步产生碎片离子m/z 655.253 0,两者质量数相差121.052 6,由精确质量计算可确定丢失的是一分子苯甲酰胺 (C6H5CONH2)。当碰撞电压增大到30 eV时,形成的碎片与15 eV电压下形成的碎片大部分相同,断裂主要发生在C-13位侧链,形成C-13位侧链离子[ScH+H]+ (m/z 286.108 5) 和失去侧链的离子 (m/z 569.237 4)。此时,m/z 776.305 6和m/z 655.253 0离子消失; m/z 569.237 4进一步失去一分子苯甲酸 (BzOH) 和两分子AcOH形成m/z 327.1595 ; 并且还出现了苯甲酰基离子 (m/z 105.033 5) 和苯甲酰胺离子 (m/z 122.061 0); 其中,m/z 122.061 0、m/z 240.102 0和m/z 291.137 3等碎片离子是文献中未报道的,归 属见图 3

Figure 2 MS/MS spectra of paclitaxel in positive ion mode,(a) MS/MS (854>),collision energy 15 eV; (b) MS/MS spectra of paclitaxel based on in-source CID spectrum of [M+H]+ ion at m/z 854

Figure 3 The fragmentation pathway of paclitaxel in positive ion mode

为了进一步了解子离子的断裂信息,首先通过升高源内解簇电压 (DP) 将紫杉醇打碎,找到与紫杉醇二级质谱碎片离子一致的离子,然后再对其进一步进行四级杆CID (MS/MS) 分析,获得相应的子 离子质谱图,用于待测物裂解规律的研究。由图 2b可以看出,分子骨架 (m/z 569.237 1) 和C-13位侧链 (m/z 286.108 3) 的裂解均可产生很强的苯甲酰基离子峰 (m/z 105.033 7),而m/z 836.326 0裂解未产生 苯甲酰基离子峰。上述结果提示: 当C-13位侧链存在时不易发生失去苯甲酰基的裂解反应,即紫杉醇C-13位侧链的失去优先于苯甲酰基的断裂,两者表现出一定的竞争关系; 并且m/z 268.097 5和m/z 240.102 2离子也可以由m/z 286.108 3离子分别失去H2O和H2O+ CO产生。

2.2 多烯紫杉醇二级质谱分析

图 1所示,多烯紫杉醇与紫杉醇相比,结构上的微小差异在于紫杉烷环的C-10位和C-13位侧链上取代基不同,紫杉醇C-10位上取代基为乙酰氧基,而多烯紫杉醇是羟基。多烯紫杉醇质量测定的精度见表 2

Table 2 Predicted ion structure,measured and calculated m/z value and mass errors of ESI-MS2 product ions obtained from the [M+H]+ of docetaxel

本文研究多烯紫杉醇的裂解也用了15 eV和30 eV碰撞电压,但两者产生的碎片离子一致,故仅列出了30 eV的数据。 如图 4图 5所示,多烯紫杉醇[M+H]+ (m/z 808.353 4) 准分子离子峰可以直接失去C-13 位侧链上的叔丁基形成m/z 752.292 0; 多烯紫杉醇C-13位侧链与分子骨架连接处的C-O键易发生断裂,形成侧链离子 (m/z 282.134 0) 和失去侧链的分子骨架离子(m/z 527.227 0); m/z 282.134 0失去末端叔丁基 (t-Boc) 形成m/z 226.071 7; m/z 527.227 0失去一 分子H2O、BzOH和AcOH形成基峰m/z 327.159 7,m/z 327.159 7失去一个H2O生成m/z 309.148 5。

Figure 4 MS/MS spectra of docetaxel in positive ion mode,collision energy 30 eV

Figure 5 The fragmentation pathway of docetaxel in positive ion mode

与紫杉醇不同,多烯紫杉醇的C-13位侧链断裂后形成的侧链离子丰度低,大部分可以进一步裂解,说明侧链取代基的改变使多烯紫杉醇产生的侧链气相离子不如紫杉醇侧链离子稳定。当碰撞电压为30 eV时,紫杉醇和多烯紫杉醇的碎片离子m/z 509丰度都较高,它分别是由紫杉醇失去侧链、一分子AcOH和多烯紫杉醇失去侧链、一分子H2O形成的。紫杉醇和多烯紫杉醇失去侧链后结构上的区别仅在于C-10位上的取代基不同,即紫杉醇是乙酰氧基,而多烯紫杉醇则是羟基。由此推测,m/z 509是由两种药物失去侧链后脱去C-10位上的取代基形成的。多烯紫杉醇的质谱裂解途径见图 5

通过源内CID将离子打碎,m/z 752.292 1可产 生m/z 182.082 0碎片离子,未产生苯甲酰基离子峰 (m/z 105.033 5),而m/z 527.227 5的裂解可产生很强的m/z 105.033 7,说明C-13位侧链与分子骨架连接处的C-O键未断裂时不易脱去母环上的苯甲酰基。

小结

在ESI+下,紫杉醇和多烯紫杉醇主要的裂解 途径相同,都容易失去侧链并脱去二萜骨架上的取代基,说明取代基的改变对紫杉醇类药物质谱裂 解产生的影响较小。裂解形成的m/z 105.033 7、m/z 291.137 3、m/z 309.148 5、m/z 327.159 7、m/z 387.181 2和m/z 509.217 4是两种药物的共同碎片,利用这些共同碎片,通过前体离子扫描方式可实现对天然产物或体内药物代谢产物中能产生共同特征碎片离子的紫杉烷类化合物实现快速定性分析。

参考文献
[1] Saloustros E, Georgoulias V. Docetaxel in the treatment of advanced non-small-cell lung cancer[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2008, 8: 1207-1222.
[2] Saloustros E, Mavroudis D, Georgoulias V. Paclitaxel and docetaxel in the treatment of breast cancer[J]. Expert Opin Pharmacother, 2008, 9: 2603-2616.
[3] Thuss-Patience PC, Kretzschmar A, Reichardt P. Docetaxel in the treatment of gastric cancer[J]. Future Oncol, 2006, 2: 603-620.
[4] Yang XL. Paclitaxel and docetaxel[J]. Pract Pharm Clin Rem (实用药物与临床), 2010, 13: 281-283.
[5] Chang Y, Abliz Z, Li LJ, et al. Fragmentation behavior of 4(20)-methylene 5/7/6 type taxoids by FAB-MS/MS[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2000, 35: 526-530.
[6] Yu H, Straubinger RM, Cao J, et al. Ultra-sensitive quantification of paclitaxel using selective solid-phase extraction in conjunction with reversed-phase capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2008, 1210: 160-167.
[7] Madhusudanan KP, Chattopadhyay SK, Tripathi VK, et al. LC-ESI-MS analysis of taxoids from the bark of Taxus wallichiana.[J]. Biomed Chromatogr, 2002, 16: 343-355.
[8] Abliz Z, Fang QC, Liang XT, et al. Study on fragmentation behavior of taxoids by tandem mass spectrometry[J]. Chin Sci Bull, 2000, 45: 688-693.
[9] Zhang J, Duan JC, Liang Z, et al. Separation and identification of Taxol in the crude extracts of Taxus cuspidata and its callus culture with HPLC-ESI-MS/MS[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2006, 41: 863-866.
[10] Zhou MJ, Zhong DF, Sun YM, et al. Electrospray ion trap mass spectrometry of eight aminoglycosid e antibiotics[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2004, 39: 826-830.
[11] Zhou DW, Xu YL, Wu JL. ESI fragmentation studies of six unusual nucleotide sugars[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2012, 47: 374-379.