药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1817-1822   PDF    
肠道细菌对柚皮苷的代谢研究
张蔚, 江曙, 钱大玮, 尚尔鑫, 钱叶飞, 任浩, 管汉亮, 段金廒     
南京中医药大学, 江苏省方剂高技术研究重点实验室, 江苏 南京 210046
摘要:研究人体肠道细菌对柚皮苷的代谢。采集健康志愿者新鲜粪便,称重稀释后厌氧培养,通过反复涂布分离得到69种人体肠道细菌。采用UPLC-Q-TOF/MS研究柚皮苷经粪便混合菌及分离的单菌作用后的代谢产物,共鉴定出乙酰化结合产物、苷元及氢化的苷元3种代谢产物;其中对柚皮苷有特殊代谢活性的4种单菌采用16S rRNA进行了鉴定,分别为Enterococcus sp.30、Bacillus sp.46、Escherichia sp.54和Escherichia sp.63。结果显示肠道细菌对柚皮苷有代谢作用且由不同细菌完成。
关键词柚皮苷     肠道细菌     UPLC-Q-TOF/MS     代谢产物     16S rRNA    
Metabolism of naringin produced by intestinal bacteria
ZHANG Wei, JIANG Shu, QIAN Da-wei , SHANG Er-xin, QIAN Ye-fei, REN Hao, GUAN Han-liang, DUAN Jin-ao    
Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
Abstract: Naringin has been reported to possess a wild range of biological activities. However, the route and metabolites of naringin produced by intestinal bacteria are not well understood. In this paper, different bacteria were isolated from human feces and their abilities to convert naringin to different metabolites were studied. Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) with automated data analysis software (MetaboLynxTM) was applied to fast analysis of naringin metabolites. Using MSE and mass defect filter techniques, three metabolites were detected and tentatively identified. The results indicated that acetylation, hydrolyzation and hydrolyzation with hydrogenation were the major metabolic pathways of naringin in vitro. Then, we studied the gene sequence of the 16S rRNA of the bacteria by extraction of genomic DNA of the strain, PCR amplification and clone of the 16S rRNA. The consequence proved that Enterococcus sp.30, Bacillus sp.46, Escherichia sp.54 and Escherichia sp.63 have the peculiar metabolism characteristic of naringin.
Key words: naringin     intestinal bacteria     UPLC-Q-TOF/MS     metabolite     16S rRNA    

人肠道中大约有100多种总数超过100兆的细菌栖息,其中99% 为厌氧菌,这些细菌统称为“肠内细菌群”,共同构成了肠道的微生态环境[1, 2]。肠道菌群能产生多种药物代谢酶,主要包括有水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等[3]。口服药物进入肠道后,不可避免地在肠道菌群作用下发生代谢转化,产生出具有不同生物活性的代谢产物,因此肠道菌群在人体的药物代谢活动中扮演着重要角色[4]

柚皮苷是中药枳实、枳壳、化橘红和陈皮的主要有效成分,在降血脂、镇静、抗氧化、抗肿瘤、抗真菌、抗动脉粥样硬化等方面具有较强的生物活性[5, 6]。柚皮苷的体内代谢研究[7, 8, 9]及其在人粪便混合菌和小鼠粪便混合菌中的代谢研究虽有报道,但对于其活性代谢单菌的研究尚未见报道[10]

目前在缺少对照品情况下开展代谢物研究,常用的方法为LC-MS联用法,具有高分辨率、高准确性、高灵敏度等显著特点。UPLC-Q-TOF-MSE联用技术并结合代谢物寻找软件MetaboLynxTM常用于中药化学成分的定性分析。通过将含药样品与空白样品比对进行分析,去除所有干扰离子而简化质谱图,从而能从复杂生物基质中快速检测药物代谢物。目前这一方法已经得到普遍认可并被广泛应用。

本研究采集了健康志愿者新鲜粪便后通过反复的涂布和培养,最终分离得到69种人体肠道细菌。采用UPLC-Q-TOF/MS 仪器与MetaboLynxTM软件寻找柚皮苷与人体肠道混合菌及单菌培养后的代谢产物,并用16S rRNA对具有特殊代谢活性的细菌进行了鉴定,为全面了解肠道细菌对柚皮苷的代谢作用提供依据[11, 12]。此外,本研究方法还可用于其他多种复杂化合物的细菌代谢分析,对于其在肠道中的吸收和代谢情况的进一步探寻有着一定意义。

材料与方法 仪器与试药

UPLC AcquityTM系统 (Waters公司); SynaptTM Q-TOF质谱仪 (Waters公司),配有电喷雾离子源(ESI); Masslynx 4.1质谱工作站软件 (Waters公司); MetaboLynxTM分析软件 (Waters公司); MLS-3750型高压蒸汽灭菌器 (SANYO公司); GNP-9080型隔水式恒温培养箱 (上海三发科学仪器有限公司); WD- 9402A型PCR扩增仪 (北京六一仪器公司); DYY-8C电泳仪 (北京六一仪器公司); TGL-16B高速离心机 (上海安亭科学仪器厂); XW-80A微型涡旋混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司); TD2102电子天平 (赛多利斯科学仪器有限公司); EPED型超纯水系统 (南京易普达易科技发展有限公司)。

柚皮苷购自中国食品药品检定研究院(批号: 110722-200610); DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒 (上海博亚生物技术有限公司); 乙腈 (TEDIA) 色谱纯; 甲酸 (Merck) 色谱纯; 其余试剂为分析纯。

UPLC检测条件

色谱柱: Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2.1 mm,1.7 μm) 柱; 流动相: 乙腈 (A) - 0.1% 甲酸水 (B),梯度洗脱 (0~7.5 min,10%~40% A; 7.5~9 min,40%~90% A; 9~10 min,90% A; 10~12 min,10% A),柱温35 ℃,流速0.4 mL·min-1,进样量5 μL。

MS检测条件

ESI源,扫描方式: ESIˉ模式; 毛细管电压: 2 kV; 锥孔电压: 40 V; 离子源温度: 120 ℃; 脱溶剂气温度: 350 ℃; 锥孔气流量: 50 L·h-1; 脱溶剂气流量: 600 L·h-1; 碰撞能量 (6~40 V); 离子能量: 1 V; 质量扫描范围: m/z 100~1 000; 准确质量测定采用芦丁溶液为锁定质量溶液; 数据采集模式: 碰撞能量梯度 (MSE); 数据分析: 质量亏损过滤 (MDF)。

对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷对照品适量,用甲醇超声溶解,配制成质量浓度为5 mg·mL-1的对照品溶液,于4 ℃保存备用。

普通厌氧培养液(GAM)、生理盐水的配制及灭菌

(GAM)生理盐水的配制及灭菌 精密称取胰蛋白胨10.00 g、大豆蛋白胨3.00 g、朊胨10.00 g、酵母浸膏5.00 g、血清消化粉13.50 g、牛肝浸出粉1.20 g、牛肉膏2.20 g、葡萄糖3.00 g、磷酸二氢钾2.50 g、氯化钠3.00 g、可溶性淀粉5.00 g、L-半胱氨酸盐0.30 g和硫代乙醇酸钠0.30 g,用超纯水加热溶解,调节至pH 7.2并最终定容至1 L。精密称取氯化钠2.70 g用超纯水定容至300 mL。将厌氧培养液及生理盐水在121 ℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min,冷却备用[13]

人体肠道菌液的制备

收集健康女性志愿者 (受试者无肠道疾病或代谢性疾病史,且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素) 的新鲜粪便5.0 g,与生理盐水按比例1∶4 (g∶mL) 比例混合,涡旋2 min制成混悬液,再1 000 r·min-1离心10 min得上清液,即为肠道菌液[14]

人体肠道细菌的分离及培养[15]

将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释,吸取0.1 mL适当浓度的稀释液接种在GAM琼脂平板上,均匀涂布,并在37 ℃厌氧培养。经过传代驯化和反复平板涂布,最终分离出69种细菌,分别标号为sp.1-sp.69并于4 ℃下保 存备用。

含药肠道菌液的厌氧共培养

将混合菌及各单菌分别接种在含有1.0 mL厌氧培养液的离心管中,37 ℃条件下厌氧培养24 h,即得到细菌种子液。取出涡旋1 min,用生理盐水连续10倍稀释两次。从最终稀释液中吸取0.1 mL加到含11.6 μL柚皮苷对照品溶液的0.9 mL厌氧培养液中。每种细菌平行做3份,并在37 ℃厌氧条件下培养48 h。同时做空白对照实验。

细菌供试液的制备

含药肠道菌液在培养48 h后取出,将每种细菌的3份平行培养液合并,以1~1.5倍的乙酸乙酯萃取3次,合并上清液。上清液在50 ℃烘箱中烘干,甲醇0.3 mL超声复溶,13 000 r·min-1离心10 min后吸取上清液,作为细菌样品的供试液。

代谢产物的鉴定与分析

将柚皮苷与柚皮素可能的Ⅰ相代谢途径如: 还原、羟化后还原、氧化、羟化甲基化等和可能的Ⅱ相代谢途径如: 甲基化、乙酰化、磺酸化、羟化再磺酸化、葡糖醛酸化、羟化再葡糖醛酸化、磺酸化葡糖醛酸化、双葡糖醛酸化、脱糖等输入MetaboLynx软件Metabolite List窗口中,质谱数据检测误差范围 < 10 mDa,软件自动根据采集的数据及设置的处理方法进行分析。

细菌DNA的提取、PCR扩增及目的DNA纯化

经分析细菌sp.30、sp.46、sp.54和sp.63对柚皮苷具有特殊代谢能力,故这4种细菌的16S rRNA基因测序步骤如下: 将这4种细菌接种在培养液中,厌氧培养24 h后取出,13 000r·min-1离心1 min,弃上清液后用DNA提取试剂盒提取细菌的DNA。以提取的细菌DNA为模板,通过PCR反应扩增菌株的16S rDNA基因序列。扩增反应用到两对通用引物,分别为16S- 1F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 16S-1R: AGAAA GGAGGTGATCC和16S-2F: CATGCAAGTCGARCG; 16S-2R: GGTGTGACGGGCGGT。PCR扩增的30 μL反应体系: DNA模板0.3 μL,Pfu-X7 (DNA聚合酶) 0.5 μL,10×pfu buffer 3 μL,4×dNTP 2.4 μL,上下游引物各1.5 μL,ddH2O加至30 μL。PCR扩增条件为: 94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共30个循环。最后以72 ℃ 10 min延伸后结束。扩增的PCR产物在1.0% 的琼脂糖凝胶上电泳分离,用DNA纯化试剂盒回收目的DNA片段。

基因测定及进化树构建

将纯化后得到的DNA,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因序列测定。采用Mega 5.0软件对多序列比对结果进行系统发育进化分析,用N-J法 (连接近邻法) 构建系统进化树,鉴定细菌的种类。

结果 1 柚皮苷代谢物的鉴定

采用Metabolynx软件将UPLC-Q-TOF/MS采集的MS数据进行处理,该软件以质量丢失滤过 (MDF) 处理为基础,用于复杂生物基质中快速检测药物代谢物[16, 17, 18, 19]。经MetaboLynx软件处理后,检测到的经人体肠道细菌作用后的柚皮苷及其代谢产物见表 1,且发现混合菌以及单菌sp.30、sp.46、sp.54和sp.63能将柚皮苷进行特定的代谢转化。原形化合物及其 代谢物的来源见表 2

Table 1 UPLC/ESI-MS,retention time and fragment ions of naringin and its metabolites

Table 2 Source of the parent compound naringin and its metabolites
1.1 原形化合物M1

混合菌及含30、63号细菌的样品中存在准分子离子峰为m/z [M-H]- 579的化合物M1 (tR = 4.04 min),在二级质谱中有m/z 459、271 [M-Rutinose]-、151等主要碎片离子峰,与柚皮苷对照品相同,由此确定为柚皮苷。

1.2 乙酰化产物M2

混合菌及30、54、63号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M2 (tR = 5.64 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为621,比柚皮苷的准分子离子[M-H]- (m/z 579) 多42 u,说明M2可能为柚皮苷乙酰化 (+42 u) 而形成的代谢产物。对M2进行二级质谱分析,主要有m/z 579 [M-Ac]-、501、459、313 [M-Rutinose]-、271 [M-Ac-Rutinose]-、193、151等碎片离子峰。柚皮苷5-OH与4'-OH容易结合乙酰基,经MSE分析,M2因RDA裂解产生了碎片峰m/z 501,且碎片峰m/z 501断裂糖苷键 (-308 u) 进一步裂解为m/z 193的碎片峰; 若是乙酰基结合在柚皮苷的4'-OH位置上,则理论上应该出现m/z 161的碎片峰,而在M2的质谱图中未发现。由此分析M2应是柚皮苷的5-OH乙酰化产生的代谢物,故推测M2为naringin-5-O-acetylate[20]

1.3 水解产物M3

在46、54号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M3 (tR = 6.51 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为271,推测由柚皮苷结构中脱一 分子鼠李糖和一分子葡萄糖 (-308 u) 而形成。对M3进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 177、

151、119、107、93和83。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 271通过RDA裂解反应产生m/z 151和m/z 119碎片离子,m/z 151离子进一步裂解产生m/z 107和m/z 83; 碎片离子m/z 177和m/z 93为准分子离子m/z 271分别丢失B-环和AC-环生成。其质谱断裂特征规律与柚皮素相同,由此确定M3为苷元柚皮素[21]

1.4 水解后氢化产物M4

在30和63号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M4 (tR = 4.43 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为273,比柚皮素的准分子离子 [M-H]- (m/z 271) 多2 u,推测M4可能为柚皮苷转变为柚皮素后氢化的结果。对M4进行二级质谱分析发现有m/z271、177、153、151、119和107等主要碎片离子峰,其质谱断裂特征规律与柚皮素相似,故推测是苷元氢化的产物[20, 22]

上述各代谢物的二级质谱以及其可能的裂解途径见图 1

Figure 1 UPLC-MS/MS spectra and proposed mechanism for the decomposition of the (a) M1 (m/z 579),(b) M2 (m/z 621),(c) M3 (m/z 271),(d) M4 (m/z 273) [M-H]- ion of naringin
2 对柚皮苷有特殊代谢能力细菌的鉴定

对柚皮苷有较强代谢能力的细菌30、46、54 和63号的基因登录号依次为KC819127、KC257405、KC694118和KC819121。上述几种细菌的基因进化树如图 2,经鉴定分别为: Enterococcus sp.30、Bacillus sp.46、Escherichia sp.54和Escherichia sp.63。

Figure 2 Phylogenetic tree of bacterium sp.30 (A),bacterium sp.46 (B),bacterium sp.54 (C) and bacterium sp.63(D)
讨论

柚皮苷经过肠道细菌作用后的代谢产物极性减小,可能会有利于其在肠道内的吸收。中药中多数苷类成分在口服后因亲脂性低而吸收较差不易转运到靶部位以至影响其发挥作用。文献报道苷由肠道细菌作用后的代谢产物通常极性减小,脂溶性增加,小肠吸收入血的速度由此加快而能较快达到所需血药浓度,发挥其药效作用。如黄酮类化合物甲基化后,可以很大程度上改善它们在肠道中的吸收,从而大大增加了它们的口服生物利用度[23]; 又如柚皮苷口服吸收率极低,但在Caco-2细胞模型中发现柚皮素的表观渗透系数是柚皮苷的3倍,提示柚皮素在体内更易被吸收[24]。因此推测,柚皮苷经肠道细菌作用后生成了3种极性相对减小的代谢产物,有利于其在肠道内的跨膜转运,并能加快吸收入血而发挥药效。此外,本实验中鉴定得到的细菌体外代谢柚皮苷的代谢物,与前期研究中孙国玲等[20]给大鼠灌胃毛橘红醇提物鉴定柚皮苷的体内代谢结果相吻合,均能找到乙酰化产物 (M2)、苷元柚皮素 (M3) 及柚皮素还原化代

谢物

(M4) 这3种代谢物; 前期陆林玲等[22]给大鼠灌胃四逆散水提物后发现了粪便中含有柚皮苷代谢物柚皮素 (M3) 及其还原化代谢物 (M4) 的结果也是相吻合的。

含不同种类糖的黄酮苷类化合物多数在肠道中可以转化为去糖基化的代谢产物,如已证实了乳糖酶在异戊烯基黄酮类化合物的水解过程中起着重要的作用,且水解位置通常发生在7-O-葡萄糖苷键上[25, 26]; 同一黄酮类化合物经不同的细菌代谢会产生不同的产物,这与不同菌所含不同的酶及其活性有关[10, 27],如将分离得到的人体肠道细菌与芦丁在体外同一条件下孵育,结果显示不同细菌中α-L-鼠李糖苷酶和

β-D-葡萄糖苷酶的活性不一样[12]; 本研究结果提示,Enterococcus sp.30和Escherichia sp.63中含有乙酰化酶、α-L-鼠李糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶及氢化还原酶,Bacillus sp.46中含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶这两种水解酶,Escherichia sp.54中含有乙酰化酶、α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶。

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