药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1823-1828   PDF    
UPLC-MS/MS方法研究中乌头碱的大鼠CYP450代谢产物及途径
毕云枫1,2, 刘舒2, 张瑞兴2, 宋凤瑞2 , 刘志强2    
1. 吉林农业大学食品科学与工程学院, 吉林 长春 130118;
2. 中国科学院长春应用化学研究所, 长春质谱中心, 吉林 长春 130022
摘要:采用大鼠微粒体与中乌头碱体外孵育,确定中乌头碱经大鼠肝微粒体P450代谢的主要产物。具有高分辨功能的超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)方法用于分析鉴定中乌头碱的代谢产物。在孵育体系中发现中乌头碱原形和6种代谢产物(M1~M6),利用串联质谱进行结构表征,确定分别为中乌头碱的去甲基、去乙酰基、脱氢及羟基化产物。利用CYP450亚型酶(CYP2C、CYP1A2、CYP2D、CYP3A、CYP2E1)的特异性抑制剂,结合UPLC-MS/MS的多反应监测(MRM)方法,确定了中乌头碱在大鼠肝微粒体中的代谢途径。CYP3A为中乌头碱的主要代谢酶;各代谢产物还可由CYP2C、CYP2D所代谢。CYP2E1和CYP1A2对中乌头碱无代谢作用。
关键词中乌头碱     细胞色素P450     代谢     特异性抑制剂探针    
Metabolites and metabolic pathways of mesaconitine in rat liver microsomal investigated by using UPLC-MS/MS method in vitro
BI Yun-feng1,2, LIU Shu2, ZHANG Rui-xing2, SONG Feng-rui2 , LIU Zhi-qiang2    
1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
2. Changchun Center of Mass Spectrometry, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Science, Changchun 130022, China
Abstract: Mesaconitine was incubated with rat liver microsomes in vitro. The metabolites of mesaconitine in rat liver microsomes were identified by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method with high resolution power. A typical reaction mixture of 100 mol·L-1 Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.5 g·L-1 microsomal protein and 50 μmol·L-1 mesaconitine was prepared. The above reaction mixture was divided into six groups, and the volume of each group was 200 μL. The incubation mixture was pre-incubated at 37 ℃ for 2 min and the reactions were initiated by adding NADPH generating system. After 90 min incubation at 37 ℃, 200 μL of acetonitrile was added to each group to stop the reaction. The metabolites of mesaconitine were investigated by UPLC-MS/MS method. Mesaconitine and 6 metabolites M1-M6 were found in the incubation system. The structures were characterized according to the data from MS/MS spectra and literatures. The metabolic reactions of mesaconitine in rat liver microsomes included the demethylation, deacetylation, dehydrogenation and hydroxylation. The major metabolic pathways of mesaconitine in rat liver microsomes were determined by UPLC-MS/MS on multiple reaction monitoring (MRM) mode combined with specific inhibitors of cytochrome P450 (CYP) isoforms, including α-naphthoflavone (CYP1A2), quinine (CYP2D), diethyldithiocarbamate (CYP2E1), ketoconazole (CYP3A) and sulfaphenazole (CYP2C), separately. Mesaconitine was mainly metabolized by CYP3A. CYP2C and CYP2D were also more important CYP isoforms for the metabolism reactions of mesaconitine, but CYP1A2 and CYP2E1 haven't any contribution to MA metabolism in rat liver microsomes.
Key words: mesaconitine     cytochrome P450     metabolism     specific inhibitor probe    

乌头属中药在我国临床上有着悠久的应用历史。具有祛寒、止痛、祛风湿的作用。中乌头碱 (mesaconitine,MA) 是乌头类生物碱中起主要活性的双酯型生物碱,它被认为是乌头中最有效的止痛剂之一[1]。中乌头碱和乌头碱的化学结构非常相似,区别仅仅是乌头碱的N原子上连接的是乙基,中乌头碱的N原子上连接的是甲基。中乌头碱也具有很强的毒性。服用过量容易引起心率不齐,甚至死亡。因此,明确中乌头碱的代谢产物及其代谢途径,对乌头属中药的临床用药及与其他药物的联合应用具有重要意义。中乌头碱的体内代谢相关研究较少,陈苹苹等[2]对大鼠灌胃给药后,液相色谱-电喷雾串联质谱法检测尿中中乌头碱的代谢产物发现4个Ⅰ级代谢产物: 羟基新乌头碱、1-O-去甲基新乌头碱、去氧新乌头碱、新乌头次碱; 及1个Ⅱ级代谢产物新乌头次碱葡糖醛酸结合物。LC-MS/MS方法在药物代谢研究中被广泛应用[3, 4],并被用于乌头属植物中的乌头碱、中乌头碱等的定量研究[5, 6]

肝脏是药物代谢的最重要器官,同时在解毒和排除异源物质方面起重要作用。药物的代谢主要通过肝脏中的细胞色素P450 (CYP450)[7, 8, 9]来完成。而CYP中最主要的亚型酶为CYP1A2 (13%)、CYP2C (20%)、CYP2D (2%)、CYP2E1 (7%) 和CYP3A (29%)[10]。通过药物代谢的研究可以阐明药物的代谢途径及参与药物生物转化的酶,进而对相关药物在人体内的代谢规律及特征进行预测,确定可能影响药物性质的理化因素及可能发生的药-药相互作用,为新药的研发和药物临床应用的安全性提供依据。本文采用超高效液相色谱-高分辨串联质谱联用 (UPLC-MS/MS) 方法对中乌头碱在大鼠肝微粒体中的主要代谢产物进行了研究,根据串联质谱数据鉴定出6种代谢产 物,并确定了其可能结构。此外,采用CYP450亚型酶的特异性抑制剂探针与UPLC-MS/MS多反应监测 (MRM) 方法相结合,确定了中乌头碱主要的大鼠CYP450代谢亚型酶,阐明了中乌头碱在大鼠CYP450中的代谢途径。

材料与方法 药品与试剂

α-萘黄酮购自Aldrich公司; 磺胺苯吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸铵、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-NADP均购自Sigma公司; 奎那定、酮康唑购自日本TCI公司。以上试剂纯度均大于98%。甲醇、乙腈 (色谱纯): 美国Fisher公司产品; 水为二次去离子水。中乌头碱和利血平对照品 (>98.5%) 均购自中国食品药品检定研究院。

仪器

Waters Xevo-TQ三级四极杆质谱仪,配备Acquity UPLC系统,同时配有Waters Masslynx V4.1数据工作站 (美国Waters公司,USA); Waters Synapt G2 HDMS离子淌度质谱仪,配备Acquity UPLC系统(美国Waters公司,USA)。Sanorius BSl10S分析天平(北京赛多利斯有限公司产品); Optima L-100×P制备型超速离心机 (贝克曼库尔特实验系统 (苏州) 有限公司); DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机 (宁波新芝生物科技股份有限公司); Eppendorf 5810R台式高速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司); MDF-382E型超低温冰箱 (日本SANYO公司)。

动物

清洁级雄性SD大鼠6只,体重 (200 ± 20) g,由吉林大学实验动物中心提供,合格证号: (吉) 2008- 0005。

肝微粒体制备

大鼠肝微粒体制备及蛋白含量测定按文献[11]方法完成。

中乌头碱经CYPs孵育后代谢产物的确定

200 μL酶反应体系,用100 mmol·L-1 Tis-HCl缓冲液 (pH 7.4) 配制,其中含有0.5 g·L-1微粒体蛋白、NADPH生产系统 (10 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸、1 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1 mmol·L-1 NADP+、4 mmol·L-1氯化镁) 及50 μmol·L-1的中乌头碱[12]。37 ℃预孵 2 min,加入NADP+ 起始反应。37 ℃孵育反应90 min后加入冰乙腈溶液200 μL终止反应,然后将孵育混合物离心30 min (12 000×g)。取上清液用于高分辨UPLC-MS/MS分析。每组平行做3份。

中乌头碱经CYPs代谢途径的确定

利用CYP450酶亚型的特异性抑制剂,结合UPLC-MS/MS (MRM) 方法,确定中乌头碱的CYP450代谢酶亚型[13]。具体实验条件如下: 用100 mmol·L-1磷酸钾缓冲液 (pH 7.4) 配制,含有0.5 g·L-1微粒体蛋白及NADPH生成体系溶液 (3.3 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸、0.4 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3 mmol·L-1 NADP+、3.3 mmol·L-1氯化镁) 的酶反应体系,分别加入以下不同代谢酶亚型的特异性抑制剂: 磺胺苯吡唑 (CYP2C) 25 μmol·L-1; α-萘黄酮 (CYP1A2) 25 μmol·L-1; 奎那定 (CYP2D) 20 μmol·L-1; 酮康唑 (CYP3A) 10 μmol·L-1; 二乙 基二硫代氨基甲酸铵 (CYP2E1) 50 μmol·L-1,每组200 μL (共6组),空白对照组用加入对应的等量抑制剂溶解液。37 ℃预孵5 min,然后加入50 μmol·L-1中乌头碱,37 ℃孵育90 min后,加入含0.02 g·L-1利血平 (内标) 的冰乙腈溶液200 μL终止反应。样品处理方法同上。每组样品平行做3份。

UPLC-MS/MS分析条件

色谱条件 UPLC® BEH RP C18色谱柱 (50 mm × 2.1 mm,1.7 μm; Waters Corp,Milford,MA,USA); 流动相A为甲醇,流动相B为5 mmol·L-1碳酸氢铵水溶液,用氨水调至pH 10.5; 洗脱条件为: 0~5 min,35%~43% A; 5~10 min,43%~45% A; 10~15 min,45%~50% A; 15~35 min,50%~65% A。流速: 0.3 mL·min-1; 柱温: 28 ℃。

质谱条件 电喷雾离子源,正离子模式: 毛细管电压2.5 kV,离子源温度350 ℃,脱溶剂气体 (N2) 流速800 L·h-1,锥孔气 (N2) 流速30 L·h-1,碰撞气 (Ar) 流速0.06 mL·min-1

结果 1 中乌头碱代谢产物的确定

图 1为中乌头碱在CYP450孵育体系中的代谢产物经UPLC-MS/MS分析的质谱总离子流图及选择离子流图,与空白灭活的CYP450反应体系比较,共有6个新增产物峰。中乌头碱及各代谢产物对应的高分辨串联质谱数据见表 1

Figure 1 Total ion chromatogram (A) and selective ion chro­matogram (B) of UPLC-MS/MS analysis of mesaconitine (MA) and its metabolites (M1-M6) formed in rat liver microsomes

Table 1 UPLC-MS/MS data of mesaconitine and its metabolites after incubation with rat liver microsomes and NADPH

表 1所示,中乌头碱的保留时间为19.13 min。准分子离子 [M+H]+m/z 632.306 0,其MS2中碎片离子为m/z 614、600、572及540 (图 2),它们分别为中乌头碱脱水 (H2O)、甲醇 (CH3OH)、乙酸 (CH3COOH) 以及同时脱甲醇和乙酸而得到的特征碎片离子,这与文献[14, 15]报道一致。

Figure 2 Spectra of MS of mesaconitine and MS2 of its [M+H]+ (m/z 632) and fragmentation pathways proposed

代谢产物M1的保留时间为5.68 min。准分子 离子 [M+H]+m/z 590.296 9,比中乌头碱的准分子离子低42 Da,所以推测M1为中乌头碱的脱乙酰基 (COCH2) 代谢产物。其MS2中的碎片离子为m/z 572、558,比对应的中乌头碱的MS2碎片离子 (m/z 614,600) 也分别低42 Da,同时其MS2碎片离子比其准分子离子分别低18、32 Da,其中减少50 Da应为 M1同时脱水 (H2O) 和甲醇 (CH3OH) 的特异性裂解,与中乌头碱特有的碎裂方式相似,进一步说明M1为中乌头碱的脱乙酰基代谢产物。所以M1为8-O-脱乙酰基中乌头碱。

代谢产物M2的保留时间为6.75 min。准分子离子 [M+H]+m/z 630.292 8,比原形药物中乌头碱低 2 Da,推测M2为中乌头碱的脱氢代谢产物。M2的MS2中主要碎片离子为m/z 598、570、538,比中乌头碱对应的MS2碎片离子 (m/z 600、572、540) 分别低2 Da,结合文献[16]中乌头碱的代谢过程,确定M2为3-脱氢中乌头碱。

代谢产物M3、M4和M6的保留时间分别为9.60、12.14和18.03 min。准分子离子[M+H]+ 均为m/z 618,比原形药物中乌头碱低14 Da,推测这3种代谢产物为中乌头碱的去甲基化代谢产物。M3、M4和M6的MS2碎片离子均为m/z 586、558和526,根据色谱保留时间,结合文献[15]的中乌头碱代谢过程,确定M3为1-去甲基中乌头碱,M4为16-去甲基中乌头碱,M6为18-去甲基中乌头碱。

代谢产物M5的保留时间为16.56 min。准分子离子 [M+H]+m/z 648.302 0,比原形药物中乌头碱高16 Da,推测为中乌头碱的羟基化代谢产物。M5的MS2碎片离子为m/z 588和556,结合文献[15]的中乌头碱代谢过程,确定M5为2-羟基中乌头碱。

2 中乌头碱的CYPs代谢途径

将UPLC-MS/MS (MRM) 方法与CYP450亚酶的特异性抑制剂探针方法相结合,用于确定中乌头碱的CYPs代谢途径。在某一亚型CYP450酶的特异性抑制剂抑制下,中乌头碱的代谢产物生成率减少或未见该产物产生,表明CYP450的此亚型酶催化此产物的生成。加入特异性抑制剂后的代谢产物与未加抑制剂组的代谢产物的峰面积相比,P < 0.05为差异显著,即为P450代谢亚型酶。结果如图 3所示。

Figure 3 Effects of the specific inhibitors of CYP450 isoforms on the formation rate of metabolites of mesaconitine in rat liver microsomes. P < 0.05 vs Control

图 3可以看出,所有代谢产物均可由CYP3A代谢。此外,有关代谢产物还可由CYP2C、CYP2D所代谢。而CYP2E1和CYP1A2对中乌头碱无代谢作用。中乌头碱在CYP450中的代谢产物结构及其代谢途径如图 4所示。

Figure 4 Proposed metabolic pathways of mesaconitine in rat liver microsomes

讨论

中乌头碱在大鼠肝微粒体CYP450中经孵育反应,利用高分辨UPLC-MS/MS法,共发现并鉴定6种中乌头碱的体外代谢产物。其中M1为8-O-脱乙酰基中乌头碱; M2为3-脱氢中乌头碱; M3为1-去甲基中乌头碱; M4为16-去甲基中乌头碱; M5为2-羟基中乌头碱; M6为18-去甲基中乌头碱。孵育结果与Ye等[15]报道的中乌头碱在人肝微粒体中的代谢产物相比,少了4个脱甲基后又脱氢的代谢产物,而多了1个脱乙酰基代谢产物,说明中乌头碱在人和鼠肝微粒体中的代谢产物既存在相同之处,也存在一定差异。Wang等[16]报道的乌头碱在大鼠肝微粒体中的代谢与Tang等[17]报道的乌头碱在人肝微粒体中代谢相比,也多了1个脱乙酰基代谢产物,同时两篇文献中乌头碱 均未有脱甲基后又脱氢的代谢产物,与本研究结果一致。中乌头碱在大鼠肝微粒体中代谢反应产物生 成量随时间延长先增加后降低,以90 min生成量最高,故反应时间定为90 min。从代谢产物可知,中乌头碱在大鼠肝微粒体中的代谢主要为脱乙酰基、脱氢、脱甲基及羟基化等代谢方式。并且,所有产物的极性均比原形药物中乌头碱增大。乌头类生物碱的 毒性主要来自C8位的乙酰基,C1、C6、C16和C18位的甲氧基[18],M1是中乌头碱C8位水解脱乙酰基 的产物,M3、M4和M6也是中乌头碱脱去相应的与毒性相关基团上的甲基,使其与中乌头碱相比,毒性大大降低。因此中乌头碱通过大鼠微粒体的代谢可 以降低毒性、增大极性。此外,利用本文方法,结合CYP450亚型酶的特异性抑制剂探针方法,可确定中乌头碱的代谢酶亚型,阐明中乌头碱的大鼠CYP450代谢途径,为进一步研究中乌头碱在联合用药时可能发生的药物相互作用提供了依据。

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