药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1829-1835   PDF    
聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的转运研究
闻真1, 李刚2, 林东海1 , 王俊腾1, 秦利芳1, 郭桂萍1    
1. 烟台大学 药学院, 山东 烟台 264005;
2. 烟台大学 生命科学学院, 山东 烟台 264005
摘要:建立Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型,研究不同表面化学性质的PLGA纳米粒在覆盖黏液层的Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的转运能力。以聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料,通过单甲氧基聚乙二醇(mPEG)及壳聚糖(chitosan)对其进行表面修饰,采用纳米沉淀法制备PLGA-NPs、mPEG-PLGA-NPs和壳聚糖包裹的PLGA-NPs,并测定其平均粒径及zeta电位。以香豆素-6(coumarin 6)为荧光标记物,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒的转运情况;以呋喃二烯(FDE)为模型药物,HPLC测定纳米粒的转运量。通过加入内吞阻断剂秋水仙素及诺可唑研究纳米粒的转运机制。采用免疫荧光法考察不同表面化学性质的纳米粒对细胞紧密连接蛋白ZO-1的影响。结果表明,纳米粒分散均匀,PLGA-NPs表面荷负电,经mPEG修饰后zeta电位近电中性,壳聚糖包裹后表面荷正电。呋喃二烯的包封率均>75%。mPEG-PLGA-NPs在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的转运能力高于PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs,在秋水仙素及诺可唑作用下转运量明显降低,并影响ZO-1蛋白的分布。说明PLGA-NPs和mPEG-PLGA-NPs可能通过胞吞作用和细胞旁路途径进行转运,CS-PLGA-NPs主要以胞吞作用进行转运;mPEG-PLGA-NPs因其表面的亲水性及电荷近中性,具有较好的抗黏性能,能够快速穿过黏液层到达细胞并转运。
关键词PLGA纳米粒     呋喃二烯     Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型     黏液     转运    
Transport of PLGA nanoparticles across Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells
WEN Zhen1, LI Gang2, LIN Dong-hai1 , WANG Jun-teng1, QIN Li-fang1, GUO Gui-ping1    
1. Pharmacy School, Yantai University, Yantai 264005, China;
2. Life School, Yantai University, Yantai 264005, China
Abstract: The present study is to establish Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells and investigate the transport capability of PLGA nanoparticles with different surface chemical properties across Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells. PLGA-NPs, mPEG-PLGA-NPs and chitosan coated PLGA-NPs were prepared by nanoprecipitation method using poly(lactic-co-glycolic acid) as carrier material with surface modified by methoxy poly(ethylene glycol) and chitosan. The particle size and zeta potential of nanoparticles were measured by dynamic light scattering. Coumarin 6 was used as a fluorescent marker in the transport of nanoparticles investigated by confocal laser scanning microscopy. The transport of furanodiene (FDE) loaded nanoparticles was quantitively determined by high performance liquid chromatography. Colchicine and nocodazole were used in the transport study to explore the involved endocytosis mechanisms of nanoparticles. Distribution of the tight junction proteins ZO-1 was also analyzed by immunofluorescence staining. The results showed that the nanoparticles dispersed uniformly. The zeta potential of PLGA-NPs was negative, the mPEG-PLGA-NPs was close to neutral and the CS-PLGA-NPs was positive. The entrapment efficiency of FDE in all nanoparticles was higher than 75%. The transport capability of mPEG-PLGA-NPs across Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells was higher than that of PLGA-NPs and CS-PLGA-NPs. Colchicine and nocodazole could significantly decrease the transport amount of nanoparticles. mPEG-PLGA-NPs could obviously reduce the distribution of ZO-1 protein than PLGA-NPs and CS-PLGA-NPs. The transport mechanism of PLGA-NPs and mPEG-PLGA-NPs were indicated to be a combination of endocytosis and paracellular way, while CS-PLGA-NPs mainly relied on the endocytosis way. PEG coating could shield the surface charge and enhance the hydrophilicity of PLGA nanoparticles, which leads mPEG-PLGA-NPs to possess higher anti-adhesion activity. As a result, mPEG-PLGA-NPs could penetrate the mucus layer rapidly and transport across Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells.
Key words: PLGA nanoparticle     furanodiene     Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell     mucus     transport    

近年来,纳米载体被公认为是一种具有良好发展前景的口服药物传递系统。它可以保护疏水性药物和生物大分子避免被胃肠消化液直接降解,并穿过胃肠道黏膜增加药物的吸收。但是,肠道黏膜的屏障作用,包括肠上皮细胞及覆盖的黏液层,成为限制开发一个有效的用于口服吸收的纳米载体的重要因素[1]

聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA) 是美国FDA批准使用的药用辅料,具有生物可降解性、低毒性和良好的生物相容性。各种微粒载体给药系统,如脂质体、聚酯类和固体脂质纳米粒表面经聚乙二醇 (PEG) 修饰后,可以屏蔽粒子的表面电荷,改善纳米粒的亲水性,减少巨噬细胞的吞噬,在血液中具有隐形和长循环作用[2, 3, 4]。经黏膜给药时,避免了黏蛋白的黏附,快速穿过黏膜黏液到达上皮细胞[5, 6]

Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞,在培养条件下可自发进行上皮样分化并形成紧密联结,其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似,因而被广泛应用于药物分子透过小肠黏膜的体外研究。但是,Caco-2单层细胞模型仍然存在一些缺陷,尤其是缺乏分泌黏液的功能[7]。HT29-MTX来源于 人结肠癌细胞,具有分泌黏液的能力,因此可以将Caco-2细胞与HT29-MTX细胞共培养,更好的模拟肠道黏膜的环境,为研制新型黏膜药物传递系统提供支持[8]

在本研究中,以聚乳酸羟基乙酸共聚物 (PLGA) 为载体材料,通过mPEG及壳聚糖对其进行表面修饰,制备PLGA-NPs、mPEG-PLGA-NPs和CS-PLGA- NPs。选择Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型作为体外模型,通过激光共聚焦显微镜和HPLC等分析方法,研究纳米粒的表面化学性质 (亲水性及zeta电位) 对其在覆盖黏液层的Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型转运的影响。

材料与方法 试剂

聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA75/25 (Mr 18 000),单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物10% mPEG2000-PLGA75/25 (10% 代表mPEG覆盖密度,mPEG Mr 2000) (济南岱罡生物科技有限公司); 壳聚糖 (低分子量,脱乙酰度75%~85%),香豆素-6 (coumarin 6,C6,> 98%),秋水仙素 (colchicine,> 95%),诺可唑 (nocodazole,> 99%) (美国Sigma公司); 呋喃二烯 (FDE,> 98%,烟台大学药学院药物分析室提供); 高糖DMEM培养基,胰蛋白酶溶液,胎牛血清,非必需氨基酸 (NEAA),Hanks缓冲盐溶液 (HBSS) (美国Gibco公司); ZO-1抗体 (美国Santa Cruz Bitechnology公司); 罗丹明123标记的山羊抗兔二抗 (北京成文免疫化学研究室); 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司); 其他试剂均为分析纯; 人结肠腺癌细胞Caco-2,人结肠癌细胞HT29- MTX (中国科学院上海细胞库)。

仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 (郑州长城科工贸有限公司); Thermo Electron LED GmbH LR56495离心机 (美国Thermo公司); NICOMP 380ZLS粒径-动电电位测定仪 (美国PSS公司); S-4800冷场发射扫描电子显微镜 (日本株式会社日立高新技术那珂事业所); CX31正置显微镜及DP26显微成像系统,Fluo View FV1000共聚焦显微镜 (日本Olympus公司); Agilent1260高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)。

包载FDEC6的纳米粒的制备

采用改良后 的纳米沉淀法制备纳米粒。称取定量的PLGA (或mPEG-PLGA) 溶于2 mL含FDE的丙酮中,作为有机相,转入Tween 80溶液 (0.2%,w/v) 30 mL中,搅拌,除去有机相并浓缩至适宜体积,即得PLGA (或mPEG-PLGA) 纳米粒胶体溶液。按上述方法,在PLGA纳米粒溶液中加入壳聚糖 (0.05%) 醋酸溶液制备得到壳聚糖包裹的PLGA纳米粒 (CS-PLGA-NPs)。将所得纳米粒溶液离心 (14 000 r·min-1,60 min),弃上清液,超纯水洗涤3次,收集沉淀,冷冻干燥备用。

同法制备包载C6的纳米粒。

形态观察

将纳米粒分散体滴至铝片表面,30 ℃烘干,喷铂金后置S-4800扫描电镜 (SEM) 下观察纳米粒的外观及形态。

粒径分布和zeta电位测定

取冻干纳米粒,用0.2% Tween 80分散成混悬液,稀释一定倍数,采用NICOMP 380 ZLS粒径电位测定仪测定纳米粒的粒径大小、粒度分布与zeta电位。

FDE的包封率测定

实验采用微柱离心-高 效液相色谱法[9]测定FDE的包封率 (EE%)。取样品0.2 mL于微型柱,用超纯水进行洗脱,离心 (1 500 r·min-1,3 min),收集离心液; 加超纯水0.2 mL,按上述条件离心,重复4次,将5次离心液合并至5 mL量瓶,加乙腈定容,HPLC测定FDE的含量 (W1)。另取未过柱的样品0.2 mL,用乙腈定容至5 mL量瓶中,HPLC测定FDE的总量 (W2)。计算公式如下:

EE = W1 / W2 × 100%

细胞培养

Caco-2细胞与HT29-MTX细胞单 独培养。采用DMEM高糖完全培养基,含10% 胎牛血清、1% 双抗 (青霉素和链霉素)、1% 非必需氨基酸、1% 谷氨酰胺。两种细胞于37 ℃、5% CO2、相对湿度90% 条件下培养,每两天换液1次,细胞长至80%~90% 汇合后用含0.25% EDTA的胰酶消化,按1∶4比例传代。

Caco-2/HT29-MTX共培养细胞染色

Caco-2与HT29-MTX以9∶1比例 (细胞数为5×104个/孔) 接种于24孔板中的玻片上,培养21天使细胞成致密单层。将玻片取出,置于4% 中性甲醛中固定30 min,采用阿利新蓝-过碘酸雪夫氏染色 (AB-PAS) 和Mager胭脂红染色对细胞进行黏液染色[10]

Caco-2/HT29-MTX共培养细胞结构的显微观察

Caco-2与HT29-MTX以9∶1比例 (细胞数为1×105个/孔) 接种于12孔的Transwell小室上室,下室加入DMEM高糖完全培养液1.5 mL,置37 ℃、5% CO2、相对湿度90% 的细胞培养箱中培养,每天对Transwell上、下室换液,培养21天。取Transwell小室上室置于4% 中性甲醛中固定30 min,进行石蜡包埋,切片,脱蜡后进行AB-PAS染色并置于扫描电镜 (SEM) 下观察Transwell膜的纵切面[11]

Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的电阻测定

将Caco-2/HT29-MTX单层细胞培养至21天,采用Millicell-ERS跨膜电阻仪于不同时间测定Caco-2/ HT29-MTX单层细胞的电阻,监测细胞模型的完整性。

纳米粒对细胞损伤的检测

Caco-2与HT29-MTX分别以细胞数1×105个/孔接种到12孔板,置37 ℃、5% CO2、相对湿度90% 的细胞培养箱中培养48 h。加入一定量的PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA-FDE-NPs及CS-PLGA-FDE-NPs (FDE质量浓度为30 μg·mL-1) 继续培养4 h,收集培养上清液,离心备用。PBS洗 涤2次后,每孔加入细胞裂解液100 μL,于4 ℃静置15 min后振荡数分钟,13 000 r·min-1离心10 min收集细胞裂解液,参照LDH试剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。

计算LDH漏出率: LDH漏出率 = 上清液中LDH活性/ (上清液中LDH活性+ 细胞裂解液中LDH活 性) × 100%

激光共聚焦显微镜观察纳米粒的转运

将Caco-2/ HT29-MTX共培养细胞培养至21天,选择电阻值大于500 Ω·cm2的Transwell进行转运实验。AP侧分别加入0.5 mL的PLGA-C6-NPs、mPEG-PLGA-C6-NPs及CS-PLGA-C6-NPs (C6质量浓度为0.8 μg·mL-1),BL侧加入HBSS溶液1.5 mL。置于37 ℃恒温水浴摇床 (55 r·min-1) 孵育15 min,取出Transwell小室上室,PBS洗涤3次,置于4% 中性甲醛中固定30 min。将Transwell上室的聚碳酸酯膜置于载玻片上,激光共聚焦显微镜 (激发光波长488 nm) 下观察。选择适当的视野进行断层 (Z轴) 扫描,分别对黏液层 (聚碳酸酯膜向外24 μm及20 μm处)、单层细胞 (聚碳酸酯膜向外6 μm处) 和聚碳酸酯膜顶部4个深度的细胞模型横切面拍摄照片。

纳米粒的定量转运及机制研究

对于AP侧至BL侧的转运,向BL侧加入HBSS溶液1.4 mL,AP侧分别加入0.5 mL的PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA- FDE-NPs及CS-PLGA-FDE-NPs (FDE质量浓度为 30 μg·mL-1)。置于37 ℃恒温水浴摇床 (55 r·min-1) 孵育,于15、30、60、120和180 min从BL侧取样品1.0 mL,并补入37 ℃ HBSS溶液1.0 mL。将待检测样品冻干,HPLC法测定FDE含量[12]。按照如下公式计算表观渗透系数 (Papp) 值。


Q为在t时间内通过单层的FDE累计总量,A为扩散面积 (cm2),C0为供侧池中FDE的初始浓度。

为考察不同理化性质的纳米粒在Caco-2/HT29- MTX共培养细胞的转运机制,加入不同的内吞阻 断剂后进行细胞转运实验。Caco-2/HT29-MTX共 培养细胞分别在含秋水仙素 (4 μg·mL-1)、诺可唑 (5 μg·mL-1) 的HBSS溶液中孵育20 min,随后更换含不同纳米粒的HBSS溶液,进行转运实验。

纳米粒对细胞紧密连接蛋白ZO-1的影响

将用HBSS稀释一定倍数的PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA- FDE-NPs、CS-PLGA-FDE-NPs加入到Transwell膜的AP侧,在培养箱中37 ℃共育2 h。共育结束后,从孔中吸出液体,PBS清洗3次。加入4% 中性甲醛,室 温孵育30 min固定细胞,吸去固定液,用PBS充分清洗去除残留固定液。加入0.2% Triton X-100,室温放置10 min,然后加入5% BSA封闭蛋白非特异性结合位点,室温放置30 min。加入ZO-1抗体在4 ℃湿盒中孵育过夜,PBS清洗3次,加入罗丹明123标记的山羊抗兔二抗,避光孵育30 min,PBS清洗3次。处理后的细胞用激光共聚焦显微镜观察拍照[13]

统计学方法

实验结果以x± s表示,用SPSS 19.0统计数据,采用Student’s t-test检验,P < 0.05为显著性差异。

结果 1 平均粒径、zeta电位及包封率测定

制备的纳米粒粒径在120~200 nm,粒子表面光滑,形状规整,大小较均匀,如图 1。mPEG-PLGA-NPs的zeta电位比PLGA-NPs约高10 mV,这是由于纳米粒表面呈电中性的PEG链屏蔽了表面电荷的作用; CS-PLGA-NPs表面因覆盖着荷正电的壳聚糖,zeta 电位在+20 mV左右。所有纳米粒对FDE的包封率均 > 75%,如表 1

Figure 1 Scanning electron microscope (SEM) images of the nanoparticles. A: PLGA-NPs (scale bar = 1.00 μm); B: mPEG-PLGA- NPs (scale bar = 1.00 μm); C: CS-PLGA-NPs (scale bar = 2.00 μm)

Table 1 Characteristics of nanoparticles. n = 3,x± s
2 Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的建立

采用AB-PAS法及Mager胭脂红法对Caco-2/ HT29-MTX单层细胞进行染色 (图 2A,2B),黏液染色呈紫红色,说明HT29-MTX细胞分泌的黏液近中性,且Caco-2细胞与HT29-MTX细胞交错生长,共同形成致密的单层。通过对Transwell膜的纵切面染色并进行扫描电镜 (SEM) 观察发现,Caco-2/HT29- MTX共培养细胞表面分布着厚度不一的黏液层 (图 2C,2D)。通过对Caco-2/HT29-MTX单层细胞模型进行21天的电阻监测,可知该共培养模型在21天时电阻可达500 Ω·cm2以上,能够形成较为致密的单层细胞模型。综上说明,Caco-2/HT29-MTX共培养细胞可以正常分泌黏液,并在21天内形成较为致密的单层细胞,能够更好地模拟肠道黏膜的环境,用于后续的转运实验。

Figure 2 Photomicrographs of Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells. A: AB-PAS staining (×400); B: Mager coccinellin staining (×400); C: Staining of Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells (×400); D: Scanning electron microscope (SEM) images of Caco-2/HT29- MTX co-cultured cells (scale bar = 10.0 μm). a: Mucus; b: Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells; c: Polycarbonate filter
3 纳米粒对Caco-2HT29-MTX细胞LDH漏出率的影响

乳酸脱氢酶(LDH) 是存在于细胞浆内参与糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一种催化酶,其漏出率是反映细胞损伤的重要指标。实验表明,PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA-FDE-NPs和CS- PLGA-FDE-NPs三组中,Caco-2细胞及HT29-MTX细胞的LDH漏出率均低于8%,与正常细胞没有显著性差异。当FDE质量浓度为30 μg·mL-1时,PLGA- FDE-NPs、mPEG-PLGA-FDE-NPs和CS-PLGA-FDE- NPs在4 h内对Caco-2细胞及HT29-MTX细胞无明显的损伤作用。

4 激光共聚焦显微镜观察纳米粒在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的转运

激光共聚焦照片显示(图 3),PLGA-NPs与CS- PLGA-NPs在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞分泌的黏液层显示较强的荧光,说明粒子被Caco-2/HT29- MTX共培养细胞分泌的黏液黏附; mPEG-PLGA-NPs滞留在黏液层的量较少,且mPEG-PLGA-NPs在聚 碳酸酯膜顶层显示更强的荧光强度,说明mPEG- PLGA-NPs与PLGA-NPs、CS-PLGA-NPs相比更易快速穿透黏液层到达上皮细胞并被转运。此结果与Caco-2/HT29-MTX共培养细胞对PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA-FDE-NPs和CS-PLGA-FDE-NPs的定量转运结果一致。

Figure 3 Confocal laser scanning micrographs of Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells excised following transport of suspension of coumarin-6 loaded nanoparticles. A: PLGA-NPs; B: mPEG-PLGA-NPs; C: CS-PLGA-NPs. a: 24 μm from polycarbonate filter; b: 20 μm from polycarbonate filter; c: 6 μm from polycarbonate filter; d: Polycarbonate filter
5 纳米粒在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的转运

FDE、PLGA-FDE-NPs、mPEG-PLGA-FDE-NPs和CS-PLGA-FDE-NPs的Papp值分别为0.98×10-6、1.92×10-6、2.67×10-6和1.48×10-6 cm·s-1。其中,mPEG- PLGA-FDE-NPs在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的累积转运量较PLGA-FDE-NPs、CS-PLGA-FDE-NPs均高出200 ng以上(P < 0.05),如图 4。经内吞阻断剂秋水仙素处理后,PLGA-FDE-NPs、CS-PLGA-FDE- NPs组60 min内检测不到FDE,mPEG-PLGA-FDE- NPs组的转运量在60 min后显著增加,如图 5A。经内吞阻断剂诺可唑处理后,CS-PLGA-FDE-NPs组180 min内均检测不到FDE; 60 min后mPEG-PLGA- FDE-NPs组的转运量较PLGA-FDE-NPs和CS-PLGA- FDE-NPs组显著增加,如图 5B。结果表明,内吞阻断剂对于纳米粒的转运结果均有影响,其中CS-PLGA- FDE-NPs经秋水仙素和诺可唑处理后转运量明显减少,推测其主要通过胞吞作用进行转运。PLGA-FDE- NPs和mPEG-PLGA-FDE-NPs经内吞阻断剂处理后,转运量减少,说明除胞吞作用外可能依赖其他途径进行转运。

Figure 4 Transport of furanodiene (FDE) loaded nanoparticles across Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells. n = 3,x± s

Figure 5 Effects of colchicine and nocodazole on the transport of nanoparticles. n = 3,x± s. A: Colchicine group; B: Nocodazole group
6 纳米粒对细胞ZO-1蛋白的影响

细胞紧密连接能够影响纳米粒的细胞旁转运,ZO-1连接蛋白是细胞紧密连接复合体的重要组分之一。图 6显示各组细胞ZO-1蛋白的表达。对照组的ZO-1均匀分布在细胞紧密连接区域 (图 6A)。PLGA- NPs孵育2 h后,个别区域出现不连续分布 (图 6B),且荧光强度变弱; mPEG-PLGA-NPs孵育2 h后,明 显改变了ZO-1蛋白的分布,荧光强度变弱(图 6C)。在CS-PLGA-NPs的作用下,与对照组差别不大,但细胞界限不明显,细胞内有弥漫状的荧光染色 (图 6D)。结果表明,与CS-PLGA-NPs相比,PLGA-NPs和mPEG-PLGA-NPs对细胞间紧密连接蛋白ZO-1均有一定程度的影响,能够打开细胞紧密连接。

Figure 6 Immunofluorescence staining of ZO-1 in Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells. A: Control; B: PLGA-NPs; C: mPEG- PLGA-NPs; D: CS-PLGA-NPs
讨论 黏液是覆盖在胃肠道等黏膜表面上皮细胞的凝胶层,其具有网格结构和非特异性的黏弹性。黏液的黏弹性可以阻止有害物质对机体的侵害,同时也是影响药物和药物载体吸收的一个天然屏障[14]。将分泌黏液的HT29-MTX细胞与Caco-2细胞共培养,可以构建一个具有黏液分泌能力的体外细胞模型,以更好的模拟肠道的微环境,用于正常的转运实验。

激光共聚焦结果表明,PLGA-NPs和CS-PLGA- NPs均易滞留于Caco-2/HT29-MTX共培养细胞上覆盖的黏液层。黏液中的黏蛋白链上分布高密度的疏水区域,PLGA-NPs 表面具疏水性和荷负电,易与黏液相互作用而被黏液黏附不能迅速地转运至肠上皮细胞。壳聚糖具有黏膜黏附特性,CS-PLGA-NPs表面荷正电,可以与黏液中荷负电的黏蛋白发生静电作用,长时间黏附于黏膜上[15]

据文献[16]报道,FDE具有高脂溶性,大部分被肠单层细胞摄取而不能穿过肠单层细胞。本研究结果显示,单体FDE在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞模型的转运量显著小于纳米粒的转运量。推测其原因,一方面由于FDE具有强疏水性,易与黏蛋白链上的高密度疏水区域产生黏附作用,难以快速穿过黏液层; 另一方面,FDE经细胞摄取后可能在细胞内代谢降解,难以转运至浆膜侧。PLGA-NPs、mPEG-PLGA-NPs和CS-PLGA-NPs均可以有效地提高FDE的转运量 和表观渗透系数,其中,mPEG修饰的PLGA-NPs在Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的转运能力更有优势。PLGA-NPs和mPEG-PLGA-NPs表面均带负电荷,mPEG-PLGA-NPs电位值更接近电中性。因为mPEG是不荷电的亲水性线性高分子聚合物,覆盖在PLGA- NPs的表面能够部分屏蔽其表面的负电荷,增加其亲水性,阻碍了黏液中黏蛋白对它的吸附作用,起到较好的抗黏作用,可以较快穿过黏液被细胞转运。

内吞阻断剂秋水仙素、诺可唑均可以影响纳米粒的转运,其中CS-PLGA-NPs的转运量几乎检测不到,且ZO-1免疫荧光染色实验中,CS-PLGA-NPs对ZO-1蛋白影响作用较小,推测其主要依赖胞吞作用转运。PLGA-NPs和mPEG-PLGA-NPs一方面依赖胞吞作用进行转运,另一方面可以改变ZO-1蛋白的分布,打开细胞紧密连接,可能通过细胞旁路途径进行转运。

综上,mPEG-PLGA-NPs能够增强纳米粒表面的亲水性,屏蔽粒子部分表面电荷,从而可以避免黏液黏附,较快地穿透黏液层并转运,这为研制黏膜药物传递系统提供了一种新的传递策略。

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