药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1836-1843   PDF    
贝母提取物中贝母甲素和贝母乙素的大鼠肠吸收特性
关志宇, 张丽华, 陈丽华 , 朱卫丰, 刘红宁    
江西中医药大学, 江西 南昌 330004
摘要:本文考察了浙贝母醇提浸膏中贝母甲素和贝母乙素的肠吸收特征以及配伍影响。建立了HPLC-ELSD测定肠灌流液中贝母甲素和贝母乙素含量测定的方法,并进行了方法学研究。采用大鼠在体单向灌流法,重量法校正实验结果,分别考察灌流速度、灌流液pH、性别差异、胆总管结扎、药物浓度、不同肠段、维拉帕米和配伍苦杏仁、甘草对贝母甲素、乙素肠吸收的影响。结果表明:灌流速度、灌流液pH和浓度可影响贝母甲素和贝母乙素吸收,pH 6.8和pH 7.4时吸收有显著差异(P<0.01);灌流液中药物浓度升高,贝母甲素和贝母乙素的肠吸收参数呈下降趋势,低浓度和中、高浓度间吸收速度常数(Ka)和表观渗透系数(Papp)有显著性差异(P<0.01);贝母甲素和贝母乙素在雌鼠肠道中的吸收显著低于雄鼠(P<0.01);胆管结扎可显著影响贝母甲素和贝母乙素的吸收(P<0.05),贝母甲素和贝母乙素在各个肠段均有一定吸收,且无显著性差异(P > 0.05);加入维拉帕米对浸膏中贝母甲素和贝母乙素的吸收无显著性影响(P > 0.05);苦杏仁和甘草与贝母在常用配伍剂量下皆能显著降低贝母甲素和贝母乙素的肠吸收(P<0.01),药材单煎后组合与合煎两组间二者吸收无显著性差异(P > 0.05)。实验结果说明,贝母甲素和贝母乙素的体内吸收特征基本一致,二者在整个肠道均有一定吸收,并具有显著的性别差异,吸收机制可能有主动吸收或易化扩散参与;配伍苦杏仁、甘草可降低其肠吸收速度。
关键词贝母甲素     贝母乙素     小肠吸收     单向灌流法     重量法    
Rat intestinal absorption trait of peimine and peiminine in Thunberg Fritillary Bulb extract
GUAN Zhi-yu, ZHANG Li-hua, CHEN Li-hua , ZHU Wei-feng, LIU Hong-ning    
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
Abstract: To study the in situ intestinal absorption kinetics and compatibility influence of peimine and peiminine in rats, the absorption of peimine and peiminine in small intestine (duodenum, jejunum and ileum) and colon of rats was investigated using in situ single-pass perfusion method and the drug content was measured by HPLC-ELSD. Perfusion rate, pH, concentration of drug, gender and bile duct ligation can significantly affect the absorption of peimine and peiminine, the Ka and Papp values in the condition of pH 6.8 and pH 7.4 had significant difference (P<0.01), as drug concentration increased, the absorption parameters of peimine and peiminine decreased, Ka and Papp between low concentrations and middle concentrations was significant difference (P<0.01). Verapamil can not affect Ka and Papp of peimine and peiminine which are in the extract (P > 0.05). Bitter almonds and licorice can significantly reduce the absorption of peimine and peiminine with the usual dose (P<0.01), extracted separately and together had no significant difference on Ka and Papp (P > 0.05). Experimental results show that the absorption features of peimine and peiminine are basically the same, both of them could be absorbed at all segments of the intestine in rats and had no special absorption window, and with significant differences between male and female individuals. The absorption of peimine and peiminine complies with the active transport and facilitated diffusion in the general intestinal segments. Bitter almond and licorice can reduce the intestinal absorption rate of peimine and peiminine.
Key words: peimine     peiminine     intestinal absorption     single-pass intestinal perfusion     gravimetric method    

浙贝母是百合科贝母属植物浙贝母(Fritillaria Thunbergii Miq.) 的干燥鳞茎,味苦、性寒,可清热散结、化痰止咳,醇提浸膏具有较好的抗炎、镇痛[1]、止咳、袪痰、松弛平滑肌作用[2]。文献报道,贝母甲素和贝母乙素的药理作用极相似[3],既是浙贝母的主要药效成分[4],又具有中枢抑制作用。《神农本草经》将浙贝母列为中品,临床上也有关于使用贝母致使患者出现急性中毒症状的报道。然而,目前除药效方面的研究外,有关贝母甲素与贝母乙素的研究多集中在药材或制剂的含量测定方法[5, 6]和体内药动学[7, 8, 9]方面,而对其吸收特性研究尚未见报道,为了明确二者的肠吸收特征,本文采用大鼠在体单向灌流法探讨了其吸收特征,并考察了常与浙贝母配伍的苦杏仁、甘草对贝母甲素和贝母乙素吸收的影响作用,以期为相关制剂的开发和中药贝母的配伍研究提供生物药剂学基础。

材料与方法 仪器

Waters 2695-2996高效液相色谱仪 (美国Waters公司); ELSD-2000蒸发光散射检测器 (美国Alltech公司); 超纯水机 (美国Millipore公司); 蠕动泵 (型号LEAD-1保定兰格恒流泵有限公司); 氮气吹干仪 (型号BF2000,北京八方世纪科技有限公司); 高速冷冻离心机 (Sigma公司,德国)。

药品与试剂

浙贝母、苦杏仁、甘草 (江西黄庆仁大药房,经江西中医药大学诸小兰教授鉴定为正品药材); 贝母甲素对照品 (批号: 110750-201110),贝母乙素对照品 (批号: 110751-200504),卡马西平 (批号: 100142-201105) (中国食品药品检定研究院);乙腈 (色谱纯,Fisher Scientific Acetonitrile); 维拉帕米 (成都格雷西亚化学技术有限公司,含量 ≥ 99.0%,批号: 201212175); 乌拉坦 (上海展云化工有限公司,批号1203147); 甲醇、乙腈为色谱纯; 二乙胺、氨水等为分析纯; 超纯水自制 (中药固体制剂制造技术国家工程研究中心)。

K-R试液 称取CaCl2 0.37 g,葡萄糖1.4 g,NaCl 7.8 g,KCl 0.35 g,NaHCO3 1.37g,NaH2PO4 0.32 g和MgCl2 0.02 g,加蒸馏水溶解后定容至1 L,调pH 7.4即得,备用。

浙贝母提取物 浙贝母粗粉 (20目) 浸渍48 h,用7倍量70% 乙醇以1 mL·min-1速度渗漉提取。提取液浓缩后,挥发乙醇至无醇味,真空干燥后制成相当于浙贝母药材质量为0.05 g·g-1浸膏粉 (浸膏粉中含贝母甲素为11.6 mg·g-1,贝母乙素为7.7 mg·g-1),于干燥器中保存备用。

苦杏仁、甘草以及与贝母配伍提取物 取苦杏仁、甘草和贝母-苦杏仁-甘草复方 (2∶2∶1) 分别以水为溶媒浸泡30 min,以10倍量水提取2次 (1.5 h,1 h),挤压药渣,与水煎液合并,静置12 h后过滤,浓缩,减压干燥,粉碎备用。

动物

SPF (specified pathogen free) 级SD大鼠,体重 (280 ± 20) g,雌雄各半,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号: SCXK (湘) 2011-0003。

贝母甲素、贝母乙素的HPLC-ELSD含量测定

色谱条件 色谱柱: phenomenex C18 (250 mm × 4.60 mm,5 μm),柱温25 ℃; 流动相: 乙腈 (A)∶0.1% 二乙胺水 (B); 0~2 min,70% B; 2~5 min,70%~30% B; 5~18 min,30% B; 18~33 min,70% B,体 积流量: 1 mL·min-1,进样量20 μL。ELSD检测器检测,检测器参数: 漂移管温度90 ℃; 载气流量: 2.0 mL·min-1; 增益比: 1。理论塔板数按贝母甲素计算不低于2 500。

灌流液供试品溶液的预处理方法 取灌流液200 μL,依次加入甲醇和内标各33 μL,涡旋混合1 min,加入氨水50 μL,涡旋振荡2 min,再加入乙酸乙酯 2 mL,涡旋振荡5 min,4 000 r·min-1离心10 min,取上清液于40 ℃水浴下用氮气吹干,采用流动相1 mL复溶,16 000 r·min-1离心10 min,待测。

标准曲线的绘制 取空白灌流液200 μL,依次加入各浓度的贝母甲素、贝母乙素及内标卡马西平溶液33 μL,使含有贝母甲素、贝母乙素为25、30、40、60、100和200 μg·mL-1,卡马西平100 μg·mL-1,按照上述方法处理样品,吸取离心后上清液20 μL注入液相色谱仪分析,记录贝母甲素、贝母乙素和卡马西平峰面积。

精密度实验 以空白灌流液分别配制质量浓度为50、100、150 μg·mL-1的贝母甲素、贝母乙素对照品灌流液,处理样品并测定。1天内平行测定6次,记录色谱图与峰面积。

稳定性实验 取贝母甲素、贝母乙素灌流液对照品溶液分别于0、2、4、8、16和24 h进样测定,记录色谱图与峰面积。

重现性实验 取同一贝母浸膏灌流液,按照样品处理方法操作,制备供试品溶液5份,各进样20 μL,检测并记录色谱图与峰面积结果。

加样回收率实验 取同一贝母浸膏灌流液,分别加入贝母甲素、贝母乙素对照品储备液25、50和100 μg·mL-1,制成低、中、高浓度样品,处理样品并进样20 μL测定,检测并记录色谱图与峰面积结果。

大鼠在体单向灌流肠吸收

SD大鼠禁食过夜,自由饮水,称重,腹腔注射20% 乌拉坦 (剂量5 mL·kg-1) 麻醉,固定后沿腹中线打开腹腔 (3 cm),分离待考察肠段约10 cm,于两端切口,插管并结扎。而后用37 ℃生理盐水缓慢地将肠内容物冲洗干净,用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖腹腔以保湿,采用红外灯照射保温,用饱和管路将大鼠连接到灌流装置中。

采用重量法矫正灌流液体积变化。进口处用已 知重量的装有供试液的小瓶进行灌流,开动蠕动泵,流速0.2 mL·min-1,每隔15 min在出口处用另一已知重量的小瓶收集1次 (同时更换下一个供试液小瓶和收集液小瓶),称量此时供试液小瓶和收集液小瓶的重量,并测定贝母甲素的浓度。实验持续105 min (15 min×7),结束后将大鼠处死,剪下灌流实验的肠段并剪开,测量其长度和上、中、下处周长,取平均值计算吸收段小肠面积。

不同灌流速度对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

雄性SD大鼠10只,随机分成两组,以空肠 (约10 cm) 为灌流部位,供试液药物浓度 (以贝母提取物计) 为2.8 mg·mL-1,选择灌流速度分别为0.2、0.4、0.8 mL·min-1,每个灌流速度取3个时间点,即45 min (15 min×3)。第1组灌流速度从0.2 mL·min-1逐渐升至0.8 mL·min-1; 第2组灌流速度从0.8 mL·min-1逐渐降至0.2 mL·min-1,每次灌流速度更换前用10 mL供试液灌洗肠道,采用重量法矫正灌流液体积变化并计算,比较不同灌流速度下贝母甲素吸收的KaPapp值。

不同pH值灌流液中贝母甲素、贝母乙素的吸收情况比较

不同pH值灌流液中贝母甲素、贝母乙素的吸收情况比较 用稀盐酸和稀氢氧化钠调节灌流液pH 值为6.8、7.4、8.0,质量浓度 (以贝母提取物计) 为2.8 mg·mL-1,以空肠 (约10 cm) 为灌流部位,流速为0.2 mL·min-1,每种pH值条件下实验持续时间105 min (15 min×7),用重量法矫正计算KaPapp,比较 3种不同pH值条件下贝母甲素、贝母乙素在小肠吸收的KaPapp值。

胆管结扎对贝母甲素、贝母乙素小肠吸收的影响

以十二指肠中下部至空肠上部 (约为10 cm) 为灌流部位,供试液药物浓度 (以贝母提取物计) 为2.8 mg·mL-1,灌流速度为0.2 mL·min-1,比较胆管结扎与不结扎条件下小肠吸收的KaPapp值。

贝母甲素、贝母乙素在不同吸收部位的吸收情况比较

各肠段区间如下: 十二脂肠段: 自幽门下1 cm处下行10 cm止; 空肠段: 自幽门下15 cm处下行 10 cm止; 回肠段: 自盲肠上行20 cm处下行10 cm止; 结肠段: 自盲肠后端始下行10 cm止。以质量浓度为2.8 mg·mL-1的贝母提取物K-R溶液对各肠段 灌流,流速为0.2 mL·min-1,每个肠段实验持续时间105 min (15 min×7),重量法矫正计算KaPapp,比较各肠段药物吸收的KaPapp值。

灌流液浓度对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

分别称取贝母提取物配制肠灌流液,使其中含有贝母提取物浓度分别为1.4、2.8和7 mg·mL-1。以空肠 (约10 cm) 为灌流部位,pH值7.4,灌流速度为0.2 mL·min-1,灌流持续时间105 min (15 min×7),用重量法矫正,比较低、中、高浓度下贝母甲素、贝母乙素在小肠吸收的KaPapp值差异。

性别对贝母甲素、贝母乙素大鼠肠吸收差异的影响

SD大鼠分为雌雄两组,各5只,以2.8 mg·mL-1贝母提取物K-R为灌流溶液,以空肠 (约10 cm) 为灌流部位,流速为0.2 mL·min-1,pH值7.4,进行灌流,实验持续时间105 min (15 min×7),用重量法计算KaPapp,比较雌雄大鼠贝母甲素、贝母乙素肠吸收的KaPapp值。

维拉帕米对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

采用盐酸维拉帕米抑制小肠上皮细胞的P-糖蛋白 (P-gp) 外排作用,探讨P-gp对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响作用。分别配置含0.5 mmol·L-1维拉帕米和不含维拉帕米的贝母提取物浓度为2.8 mg·mL-1的灌流液,以空肠 (约10 cm) 为灌流部位,体积流量0.2 mL·min-1,pH值7.4,进行灌流,每组实验持续105 min (15 min×7),用重量法矫正并计算KaPapp

配伍杏仁、甘草对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

将前述各药材提取物,按照贝母、苦杏仁、甘草生药材给药常用配伍剂量,设定贝母-苦杏仁 (1∶1)、贝母-甘草(2∶1)、贝母-苦杏仁-甘草 (2∶2︰1单煎、合煎) 配制肠灌流液。以小肠 (约10 cm) 为灌流部位,pH值7.4,灌流速度为0.2 mL·min-1,灌流持续时间105 min (15 min×7),用重量法矫正,比较苦杏仁、甘草对贝母甲素、贝母乙素小肠吸收的影响。

数据处理

将每组7个时间点所得吸收速度常数 (Ka) 和表观吸收系数 (Papp) 值数据,采用Grubbs法[10, 11]进行偶然误差值分析并取舍,偶然误差分析后须保证尽量多的时间点KaPapp值无显著误差,而后计算KaPapp的平均值。Grubbs法-G检验法检验公式为:

吸收参数的计算[12]


式中,Qin为肠道进口灌流液的体积 (mL); Qout 为肠道出口灌流液的体积 (mL); l为灌流肠段的长度 (cm); r为灌流肠段的平均横截面半径 (cm); Q为灌流速度 (mL·min-1),V为灌流肠段的体积 (cm3)。

利用统计分析软件SPSS 11.0处理肠吸收数据,并对贝母甲素和贝母乙素在各实验条件水平之间进行多重方差分析[13]

结果 1 贝母甲素、贝母乙素HPLC-ELSD含量测定方法学考察 1.1 专属性研究

在本实验条件下,经预处理的肠灌流液中内标卡马西平与贝母甲素、贝母乙素完全分离,内、外源性物质不干扰贝母甲素、贝母乙素的含量测定。结果见图 1

Figure 1 Representative HPLC chromatograms of peimine and peiminine: (A) blank perfusate solution; (B) perfusate solution spiked with carbamazepine; (C) perfusate solution spiked with peimine (a) and peiminine (b); (D) perfusate solution samples
1.2 标准曲线的绘制

以贝母甲素或贝母乙素进样质量 (μg) 的常用对数值x为横坐标,以二者和卡马西平面积之比的常用对数值y为纵坐标,绘制标准曲线,经回归处理,得回归方程,贝母甲素: y = 1.439 2x + 0.098 3,r = 0.999 8,贝母乙素: y = 1.759 3x - 0.925 9,r = 0.999 5。说明贝母甲素、贝母乙素在25~200 μg·mL-1内,进样量常用对数值与对照品峰和内标峰面积比值的常用对数值呈良好线性关系。

1.3 最小定量限

以基线噪音的10倍为最小定量限,贝母甲素、贝母乙素最小定量限为4.85 μg·mL-1,贝母乙素最小定量限为5.00 μg·mL-1

1.4 精密度实验

贝母甲素、贝母乙素低、中、高浓度溶液含量测定结果RSD分别为1.7%、1.6%、1.3% (贝母甲素) 和1.1%、0.9%、1.2% (贝母乙素),表明该方法精密度良好。

1.5 稳定性实验

实验结果表明,供试品溶液在24 h内稳定,贝母甲素和贝母乙素的RSD分别为1.3% 和1.5%。

1.6 重现性实验

贝母甲素和贝母乙素的RSD分别为1.7% 和1.8%,表明该方法重现性良好。

1.7 加样回收率实验

低、中、高浓度贝母甲素、贝母乙素的平均回收率为102.1% 和101.9%,RSD分别为1.5% 和1.7 %,表明该方法准确性良好。

2 贝母甲素、贝母乙素在体单向灌流肠吸收 2.1 不同灌流速度对肠吸收的影响

灌流速度对贝母甲素、贝母乙素的KaPapp有显著影响 (P < 0.05,图 2,图 3)。随着灌流速度的增大,贝母甲素的KaPapp均呈线性增大,贝母甲素Ka的回归方程为: y = 8.466 4x + 0.073 4,R2 = 0.993 1,Papp的回归方程为: y = 81.973x + 0.077 6,R2 = 0.992 3; 贝母乙素Ka的回归方程为: y = 0.165 2x + 0.002 1,R2 = 0.969 3,Papp的回归方程为: y = 17.71x + 0.277 6,R2 = 0.960 3。灌流速度可反映肠道的蠕动状态药物在肠道吸收影响,为了减少实验过程中的误差,本实验灌流速度设定为0.2 mL·min-1

Figure 2 Effect of perfusion flow rate on Ka of peimine and peiminine

Figure 3 Effect of perfusion flow rate on Papp of peimine and peiminine
2.2 不同pH值灌流液中贝母甲素、贝母乙素的吸收情况比较

在3种不同pH值条件下,贝母提取物中贝母甲素、贝母乙素在小肠吸收情况见表 1。结果表明,在所考察pH值范围内,随着pH值升高,贝 母甲素、贝母乙素的KaPapp均升高,在pH 6.8和pH 7.4的灌流液中,两者的KaPapp都具有显著性 差异 (P < 0.01); pH 7.4和pH 8.0灌流液中,二者都 无显著性差异 (P > 0.05)。

Table 1 Comparison on absorption parameters of peimine and peiminine at different pH values of parameters solutions. n = 5,x± s. **P < 0.01 vs pH 7.4 group
2.3 胆管结扎对贝母甲素、贝母乙素小肠吸收的影响

经统计分析胆管结扎组与不结扎组贝母甲素、贝母乙素的小肠吸收参数具有显著性差异 (P < 0.01,表 2),说明胆管结扎与否对贝母甲素、贝母乙素小肠吸收具有显著影响,其小肠吸收可能受胆汁排泄与分泌的影响。

Table 2 Effect with and without bile duct being ligated on intestinal absorption parameters of peimine and peiminine. n = 5,x± s. **P < 0.01 vs with bile group
2.4 贝母甲素、贝母乙素在不同吸收部位的吸收情况比较

大鼠不同肠段灌流吸收情况见表 3。结果表明,贝母甲素、贝母乙素在各肠段均有一定吸收。贝母甲素在各肠段的KaPapp由上至下呈现下降趋 势,经方差分析检验,十二指肠、空肠、回肠段之间KaPapp无显著性差异,十二指肠与结肠间KaPapp存在显著性差异 (P < 0.05),贝母乙素在各肠段的KaPapp无显著性差异 (P > 0.05)。

Table 3 Effect of different regions of intestinal on absorption parameters of peimine and peiminine. n = 5,x± s. P < 0.05 vs jejunum group
2.5 灌流液浓度对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

在3种不同浓度下,贝母提取物中指标成分在空肠的吸收情况见表 4。结果表明,低浓度和中浓度浸膏灌流液中的贝母甲素、贝母乙素小肠KaPapp存在显著性差异 (P < 0.05),中浓度和高浓度之间无显著性差异 (P > 0.05),并且KaPapp均随浓度的升高而降低,即贝母提取物或贝母甲素、贝母乙素对其自身在小肠的吸收具有浓度抑制作用[14]或饱和现象。

Table 4 Effect of concentration of peimine and peiminine in perfusion on drug absorption parameters at jejunum. n = 5,x± s. P < 0.05 vs middle concentration group
2.6 性别对贝母甲素、贝母乙素大鼠肠吸收差异的影响

比较雌、雄大鼠贝母甲素、贝母乙素肠吸收的KaPapp值,灌流吸收情况如表 5所示。结果经方差分析,表明贝母甲素、贝母乙素在雌鼠体内KaPapp明显低于雄鼠,并呈现显著的性别差异 (P < 0.01),可能与某些转运体在雌、雄大鼠体内表达水平差异有关。

Table 5 Effect of sex difference of peimine and peiminine in perfusion on drug absorption parameters at jejunum. n = 5,x± s. **P < 0.01 vs male group
2.7 维拉帕米对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

加维拉帕米组贝母甲素、贝母乙素的小肠吸收参数KaPapp分别为 (0.033 9 ± 0.002 6) min-1和 (3.411 3 ± 0.628 8) × 10-3 cm·min-1,(0.028 2 ± 0.007 7) min-1和(3.381 2 ± 1.021 1)× 10-3 cm·min-1,方差分析结果表明,其与不加维拉帕米组间无显著性差异 (P > 0.05),说明P-gp对浸膏中贝母甲素、贝母乙素吸收无影响,贝母甲素可能不是P-gp的底物。

3 配伍杏仁、甘草对贝母甲素、贝母乙素肠吸收的影响

实验结果见表 6,表明苦杏仁和甘草与贝母在常用配伍剂量下皆能降低贝母甲素和贝母乙素的肠吸收,并且具有显著性差异 (P < 0.01)。药材杏仁、甘 草、贝母三者合煎与分别单煎后再配伍,两组间贝母甲素肠吸收KaPapp有所差异,但无统计学意义。

Table 6 Effect of compatibility of peimine and peiminine in perfusion on drug absorption parameters at jejunum. n = 5,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs fritillary group
讨论

本实验经过对不同样品预处理方法和色谱条件的比较[15, 16, 17],确定采用内标法、液-液萃取处理样品及梯度洗脱的含量测定方法,消除生物样品测定过程中内源和外源性物质对贝母甲素和贝母乙素的干扰。方法学研究结果表明,该方法可较好地用于复杂体系中贝母甲素、贝母乙素的含量测定。

研究药物的肠吸收有体内、在体和离体等多种方法,在体法包括循环灌流法和单向灌流法,循环法由于流速高,可能造成肠黏膜损伤,而导致实验中药物吸收增加。单向灌流可以较好的弥补这一不足,且根据文献报道,该方法能很好地模拟人体肠道内环境,其实验结果与人体的实验结果相关性好[18, 19],因而该方法在国内外应用广泛。

单向肠灌流实验结果表明,pH值对贝母甲素和贝母乙素的肠吸收具有显著性影响,随着pH值升高,二者的KaPapp都明显增加。在偏碱性肠灌流液中,吸收明显高于pH 6.8的溶液,可能的原因是由于生物碱类成分在较高pH值条件下其解离度减小,分子型药物比例增加,有利于与生物膜接触。

据文献报道,大鼠Papp < 1.8×10-3 cm·min-1时 表示药物难于吸收[20],贝母甲素和贝母乙素的Papp虽然高于此临界值,但很接近,二者不属于易吸收的成分。由于贝母甲素和贝母乙素药效作用强,该吸 收强度可以满足正常的药用需要。研究结果表明,贝母甲素和贝母乙素在各肠段均有一定吸收,无特异性吸收部位。低、中、高浓度贝母浸膏灌流液间 的贝母甲素和贝母乙素肠吸收参数呈现下降趋势,低浓度和中、高浓度之间KaPapp有显著性差异 (P < 0.01),因此推测贝母浸膏中可能存在抑制贝母 甲素和贝母乙素吸收的成分,并可能存在剂量依赖或饱和性。结果也表明,贝母甲素的肠吸收机制可 能并非仅有被动扩散,可能还包括主动转运或易化扩散[21]

文献报道[9],贝母甲素和贝母乙素灌胃给药后,体内血药浓度-时间变化曲线具有双峰,且在雌性体内绝对生物利用度远小于雄性,推测贝母甲素可能具有肝肠循环,并且绝对生物利用度具有性别差异。本实验结果证明,胆总管结扎与否,显著影响了二者的肠吸收 (P < 0.01)。结扎胆总管后,其KaPapp均高于未结扎时的情况,说明二者存在肝肠循环。

雌雄大鼠肠灌流实验结果说明,贝母甲素和贝母乙素肠道吸收具有显著的性别差异 (P < 0.01)。根据文献[22]报道,肠道P-gp等转运体在雌、雄大鼠体内表达水平存在差异,这可能是导致许多药物存在生物利用度性别差异的影响因素之一。为此本文采用P-gp抑制剂维拉帕米进行干扰实验,添加维拉帕米组与对照组之间贝母甲素、贝母乙素的KaPapp无显著性差异,表明二者可能不是P-gp的底物,或浸膏中存在的其他成分影响了维拉帕米的作用。为进一步阐明导致此现象的原因,课题组将继续开展相关研究工作。

参考文献
[1] Zhang MF, Shen YQ, Zhu ZP, et al. Study of Chinese herbs property about pungent, warm and channel tropism of the Pi and Wi (4) analgesic effect[J]. Pharmacol Clin Chin Mater Clin Med (中药药理与临床), 1996, 11: 1-4.
[2] Zhang MF, Shen YQ. Advances in the pharmacological research on Fritillaria[J]. Shanghai Med Pharm J (上海医药), 2007, 10: 459-461.
[3] Chen KK, Chen L A, Chow TQ. The pharmacological action of peimine and peiminine[J]. J Am Pharm Assoc, 1933, 22: 638-641.
[4] Qian BC, Xu HJ. Studies on the antitussive and sedative activities of peimine and peiminine[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 1985, 20: 306-308.
[5] Wang S, Xu XP, Li T. Determination and contrastion of alkaloids and saponins in bulbus fritillariae cirrhosae and in other beimus[J]. Chin J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2002, 27: 342-344.
[6] Jiang Y, Li P. Determination of verticine and verticinone in Bulbus Fritillariae Thunbergii by HPLC-ELSD[J]. Chin Pharm J (中国药学杂志), 2005, 40: 1257-1259.
[7] Liu LL, Chen LH, Zhu WF, et al. Pharmacokinetics of peimine in rabbits[J]. Chin J Pharm (中国医药工业杂志), 2011, 42: 914-916.
[8] Chen LH, Liu LL, Liu HN, et al. Simultaneous determination of peimine and peiminine in rat plasma by LC-MS/MS and its application in the pharmacokinetic study[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2010, 45: 891-894.
[9] Chen LH, Zhang HM, Guan ZY, et al. Sex dependent pharmacokinetics, tissue distribution and excretion of peimine and peiminine in rats assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 145: 77-84.
[10] Peng JJ, Lin CC, Li J, et al. Intestinal absorption kinetics of flurbiprofen in rats[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 423-427.
[11] Yang XW. Principle and Control of Experimental Error (实验误差原理与控制)[M]. Beijing: Science Press, 2009: 62.
[12] Du D, Di LQ, Shan JJ, et al. Intestinal absorption of daphnetin by rats single pass perfusion in situ[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2009, 44: 922-926.
[13] Guan ZY, Pu CH, Zhao KJ. Study on preparation of β-cyclodextrin inclusion compound for borneolum syntheticum from huoxuezhitong capsules[J]. Chin Med Mat (中药材), 2006, 29: 66-71.
[14] Xu L, Yang ZL. Intestinal absorption properties of hesperidin by single pass perfusion model on rats[J]. Chin Pharm J (中国药学杂志), 2009, 44: 594-597.
[15] Kan D, Ge L, Yee PH, et al. Prederivatization and high-performance liquid chromatographic analysis of alkaloids of bulbs of Fritillaria[J]. J Pharm Sci, 1996, 85: 1174-1179.
[16] Wu XD, Chen JJ, Pan YJ. Simultaneous determination of peimine and peiminine in rat plasma by LC-ESI-MS employing solid-phase extraction[J]. Biomed Chromatogr, 2010, 24: 902-907.
[17] Xin GZ, Zhou JL, Qi LW, et al. Turbulent-flow chromatography coupled on-line to fast high-performance liquid chromatography and mass spectrometry for simultaneous determination of verticine, verticinone and isoverticine in rat plasma[J]. J Chromatogr B, 2010, 878: 435-441.
[18] Lennernäs H, Lee ID, Fagerholm U, et al. A residence time distribution analysis of the hydrodynamics within the intestine in man during a regional sing le-pass perfusion with Loc-I-Gut: in vivo permeability estimation[J]. J Pharm Pharmacol, 1997, 49: 682-686.
[19] Curran PF, Solomon AK. Ion and water fluxes in the ileum of rats[J]. J Gen Physiol, 1957, 41: 143-168.
[20] Fagerholm U, Johansson M, Lennernäs H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum[J]. Pharm Res, 1996, 13: 1336-1342.
[21] Kobayashi S, Tanabe S, Sugiyama M, et al. Transepithelial transport of hesperetin and hesperidin in intestinal Caco-2 cell monolayers[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1778: 33-41.
[22] Molpeceres J, Chacón M, Berges L, et al. Age and sex dependent pharmacokinetics of cyclosporine in the rat after a single intravenous dose[J]. Int J Pharm, 1998, 174: 9-18.