药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1844-1849   PDF    
载多柔比星磁性四氧化三铁的制备及体外评价
沈松1,2, 吴琳3, 王成润1, 戚雪勇2, 戈延茹2     , 金一1     
1. 浙江大学药学院, 浙江 杭州 310058;
2. 江苏大学药学院, 江苏 镇江 212013;
3. 江苏大学附属医院, 江苏 镇江 212001
摘要:本文采用水热法制备具有良好分散性的聚乙二醇(PEG)修饰的四氧化三铁(Fe3O4-PEG)纳米粒,通过透射电镜(TEM)、热重分析(TGA)等手段对其表征,考察其光热效果及对肿瘤细胞的杀伤作用,同时制备负载多柔比星(DOX)的Fe3O4-PEG纳米粒,研究其细胞毒性及联合治疗效果。结果表明,所制备的纳米粒分布均一,在水中的载药量达21%,体外释放具有pH敏感性。细胞毒性实验(MTT)结果显示,空白纳米粒具有较好的生物相容性,载药纳米粒具有较强的细胞毒性。联合治疗效果显示,光热治疗(PTT)可显著提高DOX的细胞杀伤作用。该研究表明,Fe3O4-PEG具有良好的光热效果及载药能力,可同时应用于肿瘤的光热及药物治疗,而这两种疗法具有潜在联合应用前景。
关键词光热治疗     磁性四氧化三铁纳米粒     联合治疗     pH敏感释放    
Preparation and in vitro evaluation of doxorubicin-loaded magnetic iron oxide nanoparticles
SHEN Song1,2, WU Lin3, WANG Cheng-run1, QI Xue-yong2, GE Yan-ru2     , JIN Yi1     
1. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2. College of Pharmaceutical Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;
3. Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, China
Abstract: PEG-modified magnetic Fe3O4 (Fe3O4-PEG) nanoparticles were sythesized using a solvothermal reaction and characterized with transmission electron microscopy (TEM) and thermo gravimetric analysis (TGA). The photothermal effect and photothermal destruction of cancer cells were evaluated. Then the doxorubicin loaded Fe3O4-PEG (DOX-Fe3O4-PEG) nanoparticles were prepared. The cytotoxicity and combined chemotherapy/photothermal therapy (PTT) effect were investigated. Uniform PEG coated Fe3O4 nanoparticles with particle size of 155 nm were obtained in the experiment. The loading and release of doxorubicin on Fe3O4-PEG were pH-dependent. The drug loading capacity in water was 21%. The results of MTT indicated a good biocompatiblity of Fe3O4-PEG nanoparticles and high cytotoxicity of DOX-Fe3O4-PEG. In combined therapy experiment, photothermal therapy demonstrated unambiguously enhanced chemotherapy efficacy. In conclusion, the obtained Fe3O4-PEG nanoparticles which exhibit good photothermal effect and drug loading capacity can be used for chemotherapy and photothermal therapy. The synergetic anti-tumor activity indicates the potential for the combined application of chemotherapy and photothermal therapy in cancer treatment.
Key words: photothermal therapy     magnetic iron oxide nanoparticle     combined therapy     pH-sensitive release    

随着纳米技术的发展,多种基于新型纳米材料的药物靶向传递平台开始出现,其在靶向传递、避免药物降解、延长作用时间等方面均有显著作用,较 传统材料展现出明显的优势。其中,磁性纳米粒由于其特殊的性能、稳定的性质、易于制备等特点广泛应用于生物研究,包括: 作为磁靶向材料,提高药物的肿瘤靶向作用,已报道的应用包括制备成磁性脂质体[1, 2, 3, 4]、磁性葡萄糖纳米粒[5]、磁性聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 纳米粒[6, 7]、磁性层状复合氢氧化物[8]等; 可作为成像对比剂,用于磁共振成像 (magnetic resonance imaging,MRI),以开展疾病诊断及实时监测载体的体内过程[9, 10, 11]; 可用于肿瘤的光热治疗 (photothermal therapy,PTT)[12, 13],作为一种新型的光热材料,磁性纳米粒具有良好的光热效果,目前已有应用于肿瘤治疗的报道,与其他光热材料如碳纳米管[14]、纳米金[15]等相比具有毒性低、易于制备等特点。

多柔比星(doxorubicin,DOX) 是一种广谱抗肿瘤药,可抑制RNA和DNA的合成,对多种肿瘤均有作用,属周期非特异性药物,临床应用较广[16]。但是由于多药耐药 (multiple drug resistance,MDR) 现象的出现,导致DOX临床治疗效果不佳。因此,多种治疗方式联合应用,成为提高肿瘤治疗效果的重要手段,临床常用的联合应用主要是放疗与化疗,但由于毒副作用较大,临床应用受到一定限制。因此,开展化学药物-光热联合治疗是目前的研究热点之一,You等[15, 17]将多柔比星负载于金纳米囊开展肿瘤联合治疗,研究发现光热可促进药物释放,两者联合应用可显著提高体内外抗肿瘤效果; Park等[18]制备载多 柔比星的PLGA纳米粒后外层包裹金,结果显示联合治疗可在更短的时间产生更好的治疗效果。目前 有关利用Fe3O4纳米粒负载多柔比星用于联合治疗 的研究尚未见报道,本文制备了聚乙二醇 (PEG) 修饰的Fe3O4纳米粒,对其光热性能等方面进行了相关表征,并负载抗肿瘤药物多柔比星,考察了载药粒子的细胞毒性,并对光热治疗与化疗的联合应用进行一定研究。

材料与方法 药品与试药

多柔比星 (DOX,北京华奉联博科技有限公司); 人乳腺癌MCF-7细胞 (中国科学 院上海生化与细胞研究所); 四甲基氮唑蓝 (MTT,上海普飞生物技术有限公司); 六水合三氯化铁 (FeCl3·6H2O)、乙二醇 (EG)、无水乙醇、柠檬酸三 钠、三水合醋酸钠 (NaAc·3H2O)、聚乙二醇4000 (PEG4000) (国药化学试剂有限公司); 台盼蓝 (Sigma公司); 其他试剂均为分析纯。

仪器

透射电子显微镜 (JEM-1200EX,日本); 可调谐808 nm激光器 (中国科学院半导体研究所); 紫外可见分光光度仪 (TU-1800PC,北京普析通用仪器有限公司); 动态光散射纳米粒径仪 (ZS90,Malvern,英国); 酶标仪 (Thermo MK3,美国); 激光共聚焦显微镜 (LSM710,德国ZEISS公司)。

PEG修饰的Fe3O4的纳米粒的制备 称取5 mmol FeCl3·6H2O,1 mmol柠檬酸三钠,0.5 g PEG4000 溶于70 mL乙二醇,形成淡黄色透明溶液,然后加入NaAc 3.854 g,强力搅拌30 min后,转移至100 mL高压反应釜中,200 ℃反应10 h,取出后自然冷却至室温,利用外加磁场收集黑色产物,所得物用去离子水洗涤数遍,去除未反应的柠檬酸三钠及PEG4000,产物即PEG修饰的Fe3O4 (Fe3O4-PEG),保存在水中备用。

纳米粒的表征

利用TEM观察磁性纳米粒的形态,将样品滴在Formar为支撑膜的铜网 (300目) 上,晾干后进行观察。采用动态光散射粒度分析仪测定纳米粒的粒径及多分散性指数,取少量水分散液稀释后置于样品管中测定。TGA测试通过SCQ1000热分析系统进行,在高纯氮气保护下,流量为20 mL·min-1,测试温度从室温开始,恒定7 min,以10 ℃·mL-1的速率升温至900 ℃。

Fe3O4-PEG的光热性能研究

将Fe3O4-PEG配置成浓度为30、75、150和300 μg·mL-1的混悬液,取各浓度Fe3O4-PEG 0.5 mL,分别用808 nm激光器 (2 W·cm-2) 室温下照射5 min,每30 s测定温度并记录。

DOX的负载与体外释放 DOX的负载

将1 mmol·L-1 DOX与0.4 mg·mL-1的Fe3O4-PEG在pH 5.0、6.5、7.4及水中搅拌过夜,然后10 000 r·min-1离心去除未结合的DOX,所得物用PBS洗涤数遍,直到上清液完全无色,所得物 (标记为DOX-Fe3O4-PEG) 重悬后4 ℃保存。上清液合并收集,用UV-vis紫外分光光度计488 nm测定吸收度值,根据标准曲线计算载药量及包封率。

体外释放研究

精密称取DOX-Fe3O4-PEG纳米粒适量 (载药量约为21%),分别分散于水、pH 5.0、pH 6.5、pH 7.4介质中,配置成1 mg·mL-1的溶液,溶液体积为10 mL,在37 ℃下恒温振荡 (100 r·min-1) 进行体外释放考察,分别在1、2、4、6、8、10、12和24 h时间点取样,10 000 r·min-1离心10 min,吸出所有上清液,同时补充新鲜释放介质,取部分上清液于488 nm测定吸收度值,计算释放百分率。

细胞摄取研究

将对数生长期的MCF-7细胞约1×105个细胞接种于单孔细胞培养板中,培养24 h后,加入DOX-Fe3O4-PEG的PBS溶液,使得终浓度约为150 μg·mL-1,0.5 h后吸去培养液,PBS洗涤3遍,加入Hoechst染色15 min后,PBS洗涤3次,再加4% 多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤3次后用激光共聚焦显微镜观察。

空白及载药纳米粒的细胞毒性采用MTT法考察游离DOX、空白Fe3O4-PEG和DOX-Fe3O4-PEG 纳米粒对人乳腺癌MCF-7细胞的毒性作用。取对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化后PBS洗涤,制成4×104·mL-1的细胞悬液,将该悬液按每孔100 μL加入96孔板中,每孔细胞数为4 000个,将96孔板置于37 ℃培养箱中,在5% CO2条件下孵育24 h,显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。向上述96孔板中加入25 μL不同浓度的Fe3O4-PEG和DOX-Fe3O4-PEG的PBS溶液,继续孵育24 h后,每孔加入5 mg·mL-1 MTT溶液31.5 μL,继续培养4 h,吸出上清液,加入二甲基亚砜 (DMSO) 200 μL,15 min后用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸收度值,记录结果。每组重复3次,每个浓度设4个复孔。

空白载体的体外光热治疗效果研究

将MCF-7细胞按每孔细胞数1×104加入96孔板中,培养24 h后加入Fe3O4-PEG的PBS溶液25 μL,使得最终质量浓度为150 μg·mL-1,分别用808 nm激光器 (2 W·cm-2) 室温下照射1、2、3、4 min,继续孵育24 h后,加入Hoechst染色15 min后,PBS洗涤3次,再加入碘化丙啶 (PI) 染色15 min,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定30 min后观察。

光热化疗联合治疗效果观察将MCF-7细胞按每孔细胞数1×104加入96孔板中,培养24 h后加入DOX-Fe3O4-PEG的PBS溶液25 μL,使得DOX质量浓度为20 μg·mL-1,6 h后吸出,并用PBS洗涤3次,分别用808 nm激光器 (0.5 W·cm-2) 室温下照射1 min (溶液温度低于41 ℃),加入0.4% 台盼蓝10 min后,PBS洗涤3次,4% 多聚甲醛固定30 min后观察。

结果与讨论 1 Fe3O4-PEG的表征及光热性能研究

利用TEM对磁性纳米粒的形态进行表征,Fe3O4- PEG外观呈类球形,粒径均一,分散良好,无明显团聚现象 (图 1A)。Fe3O4-PEG在水中的平均粒径约为155 nm,多分散性指数 (PDI) 为0.064,表明粒径分布较窄,纳米粒的粒径均一。TGA测定结果见图 1B,从图中可以看出,Fe3O4在120 ℃失重约3.6%,主要是由于游离水分的挥发; 在200~700 ℃失重约12.5%,主要为柠檬酸及PEG的降解。

Figure 1 Charaction and photothermal evaluation of Fe3O4- PEG. Transmission electron microscopy (TEM) image of Fe3O4- PEG (A),TGA curves of Fe3O4-PEG (B). The heating curves of Fe3O4-PEG at various concentrations as a function of irradiation time under 808 nm laser irradiation at a power density of 2 W·cm-2 (C)

为了考察Fe3O4-PEG的光热性能,将不同浓度 的Fe3O4-PEG溶液在808 nm激光 (2 W·cm-2) 下 照射5 min,并测定温度变化,结果见图 1C。从图中可以看出,在照射5 min时,质量浓度为300 μg·mL-1时温度达到84 ℃,升高了近50 ℃,而PBS在相同 条件下温度升高不足10 ℃,表明Fe3O4-PEG具有显著的光热效果,可用于光热治疗。

2 DOX的负载与释放

首先考察了不同pH值的介质对DOX负载的影响,从图 2A中可以看出,随着pH的增加,在相同DOX浓度条件下,Fe3O4-PEG的载药量显著增加,这主要是由于DOX在酸性条件下溶解度较高。当pH值降低时,DOX以解离状态存在,DOX与Fe3O4-PEG 之间的疏水作用力减弱,载药量降低。当pH值较高时,DOX疏水性增加,其与Fe3O4-PEG之间的疏水作用力随之增加,因此载药量增加[18]。同时看出,DOX在水中仍具有良好的负载性能,载药量达到21%。由于DOX在水中较易溶解,因此以水作为负载介质。进一步考察了DOX浓度对负载量的影响,结果见图 2B。由图中可以看出,随着药物浓度的增加,载药量呈非线性增加,当DOX浓度超过200 μmol·L-1时,载药量基本不再增加,同时测定包封率,在50、100、150、200及300 μmol·L-1时包封率分别为85.2%、78.6%、74.1%、72.3% 及58.7% ,综合考虑载药量包封率,选择200 μmol·L-1作为载药浓度。

Figure 2 Drug loading and release. Quantification of DOX loading at water and PBS with different pHs (A). Quantification of DOX loading at different DOX concentrations (B). DOX release from Fe3O4-PEG over time in buffers at three pH values (C). Error bars were based on standard deviations of triplicated samples

从释放曲线(图 2C) 可以看出,随着pH值降低,药物释放加快,这主要与DOX在酸性条件下溶解度较好有关。由于在肿瘤细胞外环境及溶酶体中pH值较低,因此有利于促进DOX释放,从而产生更强的肿瘤抑制作用。

3 细胞摄取研究

MCF-7细胞对DOX-Fe3O4-PEG的摄取结果见图 3。从图中可以看出,DOX-Fe3O4-PEG具有良好的细胞摄取效果,在0.5 h时已经进入细胞。此外,细胞核内出现明亮的红色荧光说明DOX已经释放,并进入细胞核,这可能是由于载体表面的DOX快速释放的结果,释放出来的DOX很快进入细胞核产生荧光。

Figure 3 Cell uptake of DOX-Fe3O4-PEG in MCF-7 cells after 0.5 h of incubation
4 细胞毒性

空白Fe3O4-PEG纳米粒的细胞毒性实验结果见图 4A,经过24 h的孵育后,各浓度的细胞存活率均未见显著下降,即使质量浓度高达1 000 μg·mL-1,细胞存活率仍高于85%,说明PEG包裹的Fe3O4具有较低的细胞毒性。

Figure 4 Cell viability curves of MCF-7 cells incubated with different concentrations of Fe3O4-PEG (A),DOX and DOX- Fe3O4-PEG (B) for 24 h

游离DOX与DOX-Fe3O4-PEG对MCF-7的细胞毒性随浓度变化的关系图见图 4B。从图中可见,DOX与DOX-Fe3O4-PEG的细胞毒性均呈浓度依赖性,即随着浓度的增长,细胞生存率下降。DOX-Fe3O4-PEG体外抑制细胞生存的能力比DOX稍弱,可能是因为DOX-Fe3O4-PEG中的DOX释放较慢导致,这可从其 释放研究结果看出。

5 空白载体的体外光热治疗效果

为了研究体外Fe3O4-PEG对肿瘤细胞的杀伤作用及肿瘤细胞的死亡机制,利用Hoechst和PI对细胞 进行染色。由于凋亡细胞的染色质发生固缩,因此用Hoechst染色时通常会出现较正常细胞更明亮的荧光,而PI只能透过死细胞的细胞膜[19]。由图 5可见,对照细胞无PI荧光,说明细胞膜完整。在照射1~2 min时,细胞无明显变化; 照射3~4 min时,可见明亮的PI荧光,说明细胞坏死。整个过程未见凋亡小体出现,说明在光热治疗过程中细胞的主要死亡机制是坏死而非凋亡。单纯激光照射组 (Blank) 在4 min的照射过程中无明显PI荧光,说明细胞膜完整,同时也说明Fe3O4-PEG起治疗作用。

Figure 5 Fluorescence microscopic images of differently treated MCF-7 cells stained with Hoechst and PI. Scale bar = 35 μm
6 光热化疗联合治疗效果

为了考察光热与化疗联合应用的可能,实验在温和的光热条件下进行,整个过程中温度不超过41 ℃。由图 6可见,在DOX-Fe3O4-PEG处理6 h后无死亡细胞出现,但经过1 min光热治疗后,大量细胞死亡 (蓝色),而单独光热处理未见死亡细胞出现。以上结果说明,光热可以增加化疗药物的细胞毒性,提高其杀伤效果,同时也说明光热与化疗具有潜在的联合应用前景,也为热疗与化疗的联合应用提供了思路。

Figure 6 Microscopic images of MCF-7 cells after treated with DOX-Fe3O4-PEG (A),DOX-Fe3O4-PEG + laser (B),laser (C),and then stained with trypan blue
结论

本文运用水热法合成Fe3O4-PEG ,得到粒径均一、大小约为155 nm的磁性纳米粒,该纳米粒具有较低的细胞毒性及良好的光热性能。其在水中载药量可达21%,体外释放结果表明,DOX-Fe3O4-PEG的体外释放具有pH敏感性,在低pH值环境下,DOX的释放明显加快,而在生理pH下释放缓慢。这种pH敏感释放特性能够促进药物在肿瘤低pH环境下释放,从而发挥更好的肿瘤抑制作用。Fe3O4-PEG具有优良的光热性能,可快速杀伤肿瘤细胞,在光热治疗过程中,细胞的主要死亡机制是坏死而非凋亡。

本文考察了化疗与光热治疗联合应用的可能性,结果显示光热治疗可提高DOX对MCF-7肿瘤细胞的杀伤作用,两者可产生协同作用。通过两者联合应用 可减少给药剂量,降低毒副作用。该结果不仅说明化疗与光热治疗具有联合应用的潜力,同时也为化疗与其他热疗方式的联合应用研究做出有益的尝试。

参考文献
[1] Mikhaylov G, Mikac U, Magaeva AA, et al. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug-delivery system for targeting tumours and their microenvironment[J]. Nat Nanotechnol, 2011, 6: 594-602.
[2] Gultepe E, Reynoso FJ, Jhaveri A, et al. Monitoring of magnetic targeting to tumor vasculature through MRI and biodistribution[J]. Nanomedicine, 2010, 5: 1173-1182.
[3] Zhao B, Fan YC, Wang XQ, et al. Cellular toxicity and anti-tumor efficacy of iRGD modified doxorubixin loaded sterically stabilized liposomes[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 417-422.
[4] Wang L, Yang CQ, Wang J. Assemble of magnetic nanoparticles into the structure of cisplatin liposome[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 592-598.
[5] Zhou J, Zhang J, David AE, et al. Magnetic tumor targeting of β-glucosidase immobilized iron oxide nanoparticles[J]. Nanotechnology, 2013, 24: 375102.
[6] Shen JM, Gao FY, Yin T, et al. cRGD-functionalized polymeric magnetic nanoparticles as a dual-drug delivery system for safe targeted cancer therapy[J]. Pharmacol Res, 2013, 70: 102-115.
[7] Pouponneau P, Leroux JC, Martel S. Magnetic nanoparticles encapsulated into biodegradable microparticles steered with an upgraded magnetic resonance imaging system for tumor chemoembolization[J]. Biomaterials, 2009, 30: 6327-6332.
[8] Gou GJ, Liu YH, Sun Y, et al. Supra-molecular assembly and magnetic targeted slow-release effect of “dextran-magnetic layered double hydroxide-fluorouracil” drug delivery system[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 1390-1398.
[9] Cheng L, Yang K, Li Y, et al. Facile preparation of multifunctional upconversion nanoprobes for multimodal imaging and dual-targeted photothermal therapy[J]. Angew Chem Int Edit, 2011, 50: 7385-7390.
[10] Peng XH, Qian X, Mao H, et al. Targeted magnetic iron oxide nanoparticles for tumor imaging and therapy[J]. Int J Nanomed, 2008, 3: 311-321.
[11] Gao WH, Liu ST, Fan CX, et al. Pharmacokinetics, tissue distribution and magnetic resonance's response characterstics of folic acid-O-carboxymethyl chitosan ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles in mice and rats[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 845-851.
[12] Shen S, Kong F, Guo X, et al. CMCTS stabilized Fe3O4 particles with extremely low toxicity as highly efficient near-infrared photothermal agents for in vivo tumor ablation[J]. Nanoscale, 2013, 5: 8056-8066.
[13] Chu M, Shao Y, Peng J, et al. Near-infrared laser light mediated cancer therapy by photothermal effect of Fe3O4 magnetic nanoparticles[J]. Biomaterials, 2013, 34: 4078-4088.
[14] Moon HK, Lee SH, Choi HC. In vivo near-infrared mediated tumor destruction by photothermal effect of carbon nanotubes[J]. Acs Nano, 2009, 3: 3707-3713.
[15] You J, Zhang GD, Li C. Exceptionally high payload of doxorubicin in hollow gold nanospheres for near-infrared light-triggered drug release[J]. Acs Nano, 2010, 4: 1033-1041.
[16] Bibby DC, Talmadge JE, Dalal MK, et al. Pharmacokinetics and biodistribution of RGD-targeted doxorubicin-loaded nanoparticles in tumor-bearing mice[J]. Int J Pharm, 2005, 293: 281-290.
[17] You J, Zhang R, Xiong C, et al. Effective photothermal chemotherapy using doxorubicin-loaded gold nanospheres that target EphB4 receptors in tumors[J]. Cancer Res, 2012, 72: 4777-4786.
[18] Liu Z, Sun XM, Nakayama-Ratchford N, et al. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery[J]. Acs Nano, 2007, 1: 50-56.
[19] Fernandez CT, de Pablo CS, Serrano AM, et al. Induction of cell death in a glioblastoma line by hyperthermic therapy based on gold nanorods[J]. Int J Nanomed, 2012, 7: 1511-1523.