药学学报  2013, Vol. 48 Issue (12): 1850-1855   PDF    
基于DNA条形码技术探讨板蓝根及大青叶基原物种问题
孙稚颖1, 庞晓慧2     
1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 濒危药材繁育国家工程实验室, 北京 100193
摘要:本文对我国板蓝根及大青叶原植物的物种进行了探讨,以澄清分类上的混乱现象。利用PCR直接测序法对采集的全国22份样本,测定了核基因ITS2区和叶绿体matK基因片段,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。 结果表明,所研究样本ITS2片段长度为191 bp,测序峰图显示不同研究样本间具有多个单核苷酸多态性(SNP)位点,部分样本具有杂合位点;从构建的NJ树图可以看出,基于核ITS2片段,所研究样本被分成两大支,其中一支与欧洲菘蓝相聚。基于叶绿体matK序列,所研究样本也被明显分成两支。因此本研究支持板蓝根及大青叶的原植物为菘蓝(Isatis indigotica Fortune),与欧洲菘蓝(Isatis tinctoria L.)是独立的两个物种,不支持Flora of China中将二者合并的观点。
关键词菘蓝     欧洲菘蓝     DNA条形码     分类    
Discussion on the botanical origin of Isatidis Radix and Isatidis Folium based on DNA barcoding
SUN Zhi-ying1, PANG Xiao-hui2     
1. College of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
2. National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: This paper aimed to investigate the botanical origins of Isatidis Radix and Isatidis Folium, and clarify the confusion of its classification. The second internal transcribed spacer (ITS2) of ribosomal DNA, the chloroplast matK gene of 22 samples from some major production areas were amplified and sequenced. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner. Phylogenetic study was performed using MEGA 4.0 software in accordance with the Kimura 2-Parameter (K2P) model, and the phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining methods. The results showed that the length of ITS2 sequence of the botanical origins of Isatidis Radix and Isatidis Folium was 191 bp. The sequence showed that some samples had several SNP sites, and some samples had heterozygosis sites. In the NJ tree, based on ITS2 sequence, the studied samples were separated into two groups, and one of them was gathered with Isatis tinctoria L. The studied samples also were divided into two groups obviously based on the chloroplast matK gene. In conclusion, our results support that the botanical origins of Isatidis Radix and Isatidis Folium are Isatis indigotica Fortune, and Isatis indigotica and Isatis tinctoria are two distinct species. This study doesn't support the opinion about the combination of these two species in Flora of China.
Key words: Isatis indigotica     Isatis tinctoria     DNA barcodes     classification    

板蓝根和大青叶是我国传统中药材,具有清热解毒、凉血利咽作用,2010版《中国药典》规定二者来源均为十字花科植物菘蓝 (Isatis indigotica Fortune)[1]。然而,在Flora of China (2001)[2]中,我国的菘蓝已被并入欧洲菘蓝 (I. tinctoria L.),原因是二者在形态上具有多样性,存在种间过渡,不应作为两个独立的物种。我国乔传卓教授等早在1980~1982年间曾对菘蓝 (I. indigotica) 和欧洲菘蓝 (I. tinctoria) 的染色体、孢粉学、蛋白质化学以及吲哚苷的含量做过研究[3],认为菘蓝是我国原产的I.indigotica,尽管在长期栽培过程中菘蓝形态上产生了较大变异,但其染色体数为2n = 14,而欧洲菘蓝为2n = 28,另外二者所含化学成分也有所差异。明确药材的物种来源是确保药材安全有效的重要前提,因此我国传统大宗药材板蓝根和大青叶的原植物到底是菘蓝还是欧洲菘蓝,亦或是一个种?它们的遗传背景如何?尚需进一步从分子水平进行研究。

DNA条形编码[4]或称DNA条形码技术 (DNA barcoding) 是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode) 自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定[5]。自加拿大动物学家Paul Hebert[6]于2003年首次提出DNA条形码概念以来,DNA条形码研究已成为近年来生物分类学研究的热点和前沿[7, 8, 9]。对于分类学中难以区分的类群,采用DNA条形码可以抛开形态上的假象,从基因水平上提供一种分类依据[10]。本研究选取目前被广泛认可的DNA条形码候选序列: 核ITS2片段和叶绿体matK基因[11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20],对采自全国板蓝根和大青叶不同产区和研究基地的二十余份样本进行了研究和探讨,主要目的是为我国传统药材板蓝根及大青叶的基原物种的确定提供分子证据。

材料与方法 材料

从全国7个省和直辖市采集板蓝根及大青叶原植物样本共计22份。由笔者做初步形态鉴定。取新鲜叶片,硅胶干燥保存备用。供试样品来源见表 1。凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。

Table 1 Source of materials
DNA提取

取硅胶干燥叶片约10 mg,用DNA提取研磨仪 (Retsch MM400,Germany) 研磨1 min (30次/秒) 后,利用植物DNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co.,China) 提取总DNA。

PCR扩增及测序

扩增ITS2序列所用引物,正向为5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3',反向为5'-GA CGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR反应体积为25 μL,体系内含MgCl2 2 μL (25 mmol·L-1)、dNTP 2 μL (2.5 mmol·L-1)、PCR buffer 2.5 μL (10×)、引物各1.0 μL (2.5 μmmol·L-1)、Taq聚合酶1.0 U、总DNA约1 μL (~30 ng)。扩增程序: 94 ℃,变性5 min; 再进行40个循环(94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s); 最后72 ℃延伸10 min。叶绿体matK基因序列的PCR反应条件、通用引物及扩增程序参见文献[11, 12, 13, 14]。PCR仪为Peltier Thermal Cycler PTC0200 (BioRad Lab,Inc.,USA)。利用ABI3730XL对纯化的PCR产物双向测序,测序引物与PCR扩增引物一致。

数据处理

测序峰图利用CodonCode Aligner V 3.0 (CodonCode Co.,USA) 校对拼接,去除引物区,基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列[21]matK基因片段采用CodonCode Aligner处理,剔除两端测序低质量部分。此外,从GenBank下载了采自捷克的欧洲菘蓝ITS2序列DQ249851和采自新疆的乌斯玛ITS2序列AF384105。将所有序列用软件MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 4.0分析比对并进行遗传距离等分析,用NJ (邻接) 法构建系统聚类树。

结果与分析 1 序列分析 1.1 核ITS2序列分析

经序列比对分析,实验样本的ITS2间隔区序列长度为191 bp,GC含量为56.0%,具有一个PolyC结构。不同样本间具有单核苷酸多态性位点 (SNP),此外部分样本序列碱基具有杂合位点,见图 1 (样本号在每条峰图的左上角) 和表 2,如147nt处,样本LX06和AG02都是纯合的碱基T,样本ZS01和ZS02都是纯合的碱基C,而采自中国医学科学院药用植物研究所药植园和上海第二军医大学药圃的样本出现了 (T-C) 杂合位点。

Figure 1 Part ITS2 sequence peaks of studied samples (Note: SNP and heterozygosis sites)

Table 2 SNP and heterozygosis sites in ITS2 sequence of studied samples
1.2 叶绿体matK序列分析

叶绿体matK序列拼接后,除去两端引物及测序低质量部分,所研究样本matK序列长度为783 bp,GC含量为30.5%~30.8%,具有2个PolyT结构,7个PolyA结构; 包含4个SNP位点,见图 2表 3,如120 nt处,样品AG02、LX04、YZ02、YZ12的碱基是A,而样品SLNJ、ZS01和ZS02的碱基是C,均为纯合位点。

Figure 2 MatK sequence peaks of some samples (Note: SNP site)

Table 3 SNP sites inmatK sequence of studied samples
2 系统学分析 2.1 ITS2序列

基于ITS2序列,利用MEGA4.0构建的NJ系统聚类树图 (图 3) 显示,所研究样本被聚为两大分支。其中绝大多数样本聚在了第一分支,AF384105是采自新疆的菘蓝,当地人称“乌斯玛”,第二分支包括捷克的欧洲菘蓝DQ249851以及采自江苏植物研究所的3个样本和中国医学科学院药用植物研究所的YZ13。

Figure 3 Phylogenetic tree constructed by the ITS2 sequences using NJ method. The bootstrap scores (1 000 replicates) are shown (≥50%) for each branch.
2.2 matK序列

基于叶绿体matK序列,利用MEGA4.0构建的NJ系统聚类树图 (图 4) 显示,所研究样本被聚为两大分支。第一分支包括绝大多数样本,其中YZ01和YZ12又与其余样本有所区别; 第二分支为采自江苏植物所药用植物园的3个样本。

Figure 4 Phylogenetic tree constructed by the matK sequences using NJ method. The bootstrap scores (1 000 replicates) are shown (≥50%) for each branch
讨论

长期以来,国内外植物分类学界和药学界对我国菘蓝的基原植物存在分歧。王希平等[22]对菘蓝学名的考证认为 Isatis tinctoria (欧洲菘蓝) 非我国原产,而我国原产的菘蓝应是I. indigotica。乔传卓等[23]研究表明: 菘蓝和欧洲菘蓝不仅在外部形态,而且在染色体数、花粉形态及同工酶和可溶性蛋白的生化特征等方面均有明显的差异。在板蓝根的商品中,以前一些老药工在鉴别时发现,药材有“性糯”不易折断及“性硬”易折断两种类型。这说明商品药材的原植物非同一种,可能是两种不同的原植物。后来包雪生等人对菘蓝及欧洲菘蓝在生药性状、组织解剖等方面进行了系统研究,发现菘蓝根中木质部较不发达,木质部纤维较少,韧皮部占大部分,基本组织中含大量淀粉粒,干燥的根易折断,这与药工所谓“性硬”相符; 而欧洲菘蓝根木质部发达,且具较发达的木纤维,基本组织含淀粉粒少,干燥根不易折断,这与药工所谓“性糯”相符。这说明在以往的板蓝根药材中确 有菘蓝及欧洲菘蓝两种原植物。但现在商品中只有 菘蓝了,其主要原因是欧洲菘蓝须根多,质量欠佳而被淘汰[3]。本研究利用DNA条形码ITS2片段及叶绿体matK基因序列发现,所研究样本确实分为两大类群。江苏植物研究所药用植物园所取样品均独立出 来,且其ITS2序列与欧洲菘蓝聚为一支。序列结果表明此两类群间有5个稳定的碱基变异位点,参照 峰图,其碱基位点均为纯合位点。因此,研究结果认为所研究样本包含两大类,一类为菘蓝,占绝大多 数,其中包括主产区河北、安徽、河南等地所采样本; 另一类即为欧洲菘蓝,主要分布在以科研为目的的药用植物园,引种而来[24, 25]。本研究支持我国学者乔传卓及包雪生等人的研究结果,也支持一些欧洲学者[26, 27, 28]基于化学成分和分子标记确定欧洲菘蓝与菘蓝为两独立物种,不支持Flora of China中将二者合并的观点。

在所研究样本中,采自中国医学科学院药用植物研究所、上海第二军医大学的几个样本在核ITS2序列中来自双亲的碱基位点叠加形成杂合现象,并且呈现一种过渡状态,初步认为出现了基因流。据后来笔者调查,中国医学科学院药用植物研究所药用植物园、上海第二军医大学药用植物园在种植菘蓝的同时,也引种了欧洲菘蓝,所以很有可能混种在一起的菘蓝与近缘种欧洲菘蓝发生了一定程度的杂交,引种的欧洲菘蓝将其自身的某些基因带到了新的群体中,从而发生了基因流现象。基于叶绿体matK基因序列片段所得结果与核序列ITS2结果稍有差异,主要集中在变异类型YZ13的归属。核基因序列与叶绿体基因序列进化规律不同,核基因序列为双亲遗传,而叶绿体基因序列为母系遗传,前人研究报道单亲遗传构建的分支关系往往不能真正反映种内进化方向[29],两种序列就本研究的具体类群所体现的差异,值得进一步探讨。

菘蓝与欧洲菘蓝在外部形态上有一定差异,欧洲菘蓝为四倍体,植株较高大,叶绿色,常被毛,而菘蓝为二倍体,植株相对较矮,叶常呈灰绿色,被蜡质。但由于某些地区引种欧洲菘蓝与菘蓝混种,导致形态出现了过渡,从而引起对其物种认识的偏差,要解决这些由于对形态变异的认识不同而产生的分类学问题,必须借助于独立于形态特征之外的分子标记。DNA条形码用短的、标准的DNA片段作为物种标记进行鉴定,不受个体形态特征限制,可实现生物物种的快速准确鉴定,并能从基因水平提供一种分类依据。本研究基于DNA条形码候选序列ITS2与matK基因对菘蓝及欧洲菘蓝的物种分类问题进行了探讨,可为我国传统药材板蓝根及大青叶基原物种的确定提供分子证据。

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