药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1111-1116   PDF    
基因胞内传递中的内体逃逸技术
王文喜 , 代凯, 洪璐, 蔡婷, 唐岚    
浙江工业大学药学院, 浙江 杭州 310032
摘要:基因在细胞内的传递过程及胞内分布对其作用至关重要,成功的基因载体应能有效地克服内体膜 的屏障将基因送到特定的细胞器。传统的非病毒类载体由于不能有效地绕过内体途径,故具有较低的转染活性,从而限制了基因药物的应用。为了进一步提高外源基因的转染效率,已发现大量的促进内体逃逸的试剂。这些试剂可通过与内体膜融合、在内体膜内形成小孔、光激活的破膜作用或质子海绵效应等机制促进内体逃逸。本文总结了文献报道的各种内体逃逸技术,根据其作用机制的不同对其分类阐述,并说明其在基因胞内传递中的应用。
关键词基因传递     内体逃逸     致孔     质子海绵效应     膜融合     光化学内化    
The strategies of endosomal escape for intracellular gene delivery
WANG Wen-xi , DAI Kai, HONG Lu, CAI Ting, TANG Lan    
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China
Abstract: The intracellular trafficking and subcellular distribution of exogenous gene is very important for gene delivery. A successful gene vehicle should overcome various barriers including endosomal membrane bar-riers to delivery gene to the target organelle. Traditional nonviral vehicle is unable to avoid endosomal pathway efficiently, so the efficiency of gene delivery is low and the application of gene drugs is limited. In order to achieve efficient nonviral gene delivery, a lot of researches based on endosomal escape have been carried out and some agents with the function of endsomal escape have been found. These agents facilitate the endsomal escape via various mechanisms, such as fusion into the lipid bilayer of endosomes, pore formation in the endosomal membrane, proton sponge effect and photochemical methods to rupture the endosomal membrane. In this review, various reported strategies for endsomal escape are described according to the escape mechanisms, and their applications in intracellular gene delivery are also discussed.
Key words: gene delivery     endosomal escape     pore formation     proton sponge effect     membrane fusion     photochemical internalization    

如何有效地将基因药物传递至细胞内是基因治疗广泛应用急需解决的瓶颈问题之一。非病毒类载 体由于具有基因携载率高、免疫原性低和易大量制 备等优点, 已成为近年来基因载体研究开发的主要方向[1]。但与病毒类载体相比, 转染效率低是非病毒类载体最主要的问题, 这是由于基因药物要到达作用部位需克服细胞内外多种膜屏障所致。与病毒类载体类似, 大多数的非病毒类载体主要通过内吞途径进入细胞。内吞后的载体与生物膜成分组装成内体 (endosome), 随后通过多种机制发展为成熟的溶酶体。溶酶体内有大量的降解酶, 会使其内的基因药物发生降解而失效。因此, 一种有效的基因载体应能促进基因药物快速地从内体中逃离[2, 3]。近年来许多学者为此做了大量研究, 发现许多促进基因药物内体逃逸的试剂, 并用其构建了一些高效低毒的非病毒类基因载体, 取得良好效果。根据其作用机制, 本文对此作简要的综述。

1 基于膜致孔机制的内体逃逸技术

一些多肽类物质与内体膜结合, 可以在膜上形成稳定的孔道, 从而使内体中的物质释放出来。近年来已开发了大量的这种多肽类物质, 用于促进基因的细胞内传递。与其他生物膜一样, 内体膜的磷脂分子之间存在着微小的空隙, 这些空隙处于膜张力 (使空隙扩大) 和线张力 (使空隙关闭) 的平衡中。正常情况下, 空隙不会变大, 也不会导致膜内物质的渗漏。某些特殊结构的多肽类物质对空隙有很强的亲 和力, 当它们聚集于空隙边缘时, 将会显著降低线张力, 使膜张力占主导地位, 则在膜上形成相对稳定的孔道, 从而使内体中的物质释放出来[4]。这些多肽大多来源于细菌或病毒的具有穿膜功能的结构序列。目前抗菌肽的膜致孔机制已被大量研究, 明确的模型主要有桶壁孔模型 (barrel-stave pore model)、地毯模型 (carpet model) 和环孔模型 (toroidal pore model) 等[5, 6, 7]

蜂毒肽是这类逃逸试剂的典型代表, 它是由26个氨基酸残基组成的两亲性多肽。分子中的3个赖 氨酸残基和2个精氨酸残基使其成为强碱性多肽。研究表明, 当蜂毒肽处于内体的酸性环境中时, 可由随机的卷曲结构转变为α-螺旋结构, 进而与磷脂膜结合, 在膜上形成孔道, 使内体中的物质释放出来[8, 9]。Ogris等[10]将蜂毒肽接到PEI上构建基因载体。结果发现, 在多种细胞中的基因转染效率都显著提高。与未修饰的PEI相比, 绿荧光蛋白质粒DNA的表达提高了20多倍, 而荧光素酶基因的表达提高了近700倍; 而且, 基因表达的时间也显著提前。胞内分布研究结果显示, 在蜂毒肽存在的情况下, 复合物以完整的形式存在于细胞质, 进一步证明了蜂毒肽的内体逃逸性能。

李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O,LLO) 是细菌产生的帮助内体逃逸的蛋白质。在内体酸性条件 下,LLO可结合到含胆固醇的内体膜上, 经多聚体化后在膜上形成约30 nm的孔道, 从而使内体中物质 有效地进入胞浆。研究表明,LLO的这种膜致孔能 力在pH 4.9~6.7时最佳, 是一种高效的内体逃逸试剂, 被大量用于生物大分子的胞内传递[11,l2]。Mathew等[13]将LLO包封到pH敏感脂质体内作为ICAM-1反义寡核苷酸的载体。结果发现, 引入LLO后细胞内的ICAM-1 mRNA水平和蛋白表达均受到明显抑制, 而不含LLO的pH敏感脂质体几乎无抑制作用。进一步研究发现, 以LLO-pH敏感脂质体为载体的寡核苷酸2 h后分布于胞浆, 并有大量位于细胞核内, 而不加LLO的pH敏感脂质体携载的寡核苷酸主要存在于溶酶体内, 证明了LLO的促转染作用主要是高效的内体逃逸功能。Andrews等[14]研究了LLO-pH敏感脂质体携载免疫刺激序列寡核苷酸的作用效果, 结果发现细胞介导的免疫反应明显增强。

此外, 其他一些来源于病毒的、具有pH敏感性的多肽和蛋白同样具有内体逃逸性能, 近年来已被开发用于构建高效的基因载体。五邻体基质蛋白 (penton base,PB) 是腺病毒进入细胞和内体逃逸的主要物质基础。对于受体介导的跨膜转运来说,PB是高效的内体逃逸试剂, 其介导基因穿过内体膜的能力已得到证实[15, 16]。Shayakhmetov等[17]研究了由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸组成的五邻体基质蛋白对腺病毒载体转染效率和内体逃逸效率的影响。结果显 示, 去除载体上的五邻体基质蛋白, 不影响载体和细胞膜的吸附作用, 却大大降低了内化效率。该研究中用环磷酰胺对载体进行标记, 并对含有组织蛋白酶的内体进行染色, 证明了五邻体基质蛋白对内化效率的影响, 是其促进内体逃逸的结果。

2 基于质子海绵效应的内体逃逸技术

一些具有较强pH缓冲能力和柔性疏水长链的 化合物进入内体后, 可阻碍内体向溶酶体的转变, 使其携载的物质有效地逃离溶酶体。这类物质具有亲 内体特性,pKa在5~9之间, 具体的逃逸机制目前尚未完全清楚。其中最受关注的假说为质子海绵效应 (proton sponge effect), 即化合物进入内体后能吸收膜上质子泵送入的质子, 抵抗pH下降, 引起质子泵的持续开放, 使得大量的水和无机离子进入内体, 从而导致内体膜破裂[18]。但也有研究认为质子海绵效应并非该类物质内体逃逸的主要机制[19, 20]

该类内体逃逸试剂主要是一些人工合成的高分子材料, 其中最典型的代表是聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine,PEI)。PEI是一种由氮丙啶单体形成的高聚物, 重复的乙胺单元使其具有较高的水溶性。PEI有线型和支链型两种, 支链型是PEI的标准形式, 已成功地应用于细胞转染。PEI具有一系列不同分子量的同系物。从目前的研究结果来看, 当PEI的相对分子质量在600~70 000时, 随着PEI分子质量增加, 转染率增高, 细胞毒性也增大[21, 22]。PEI转染细胞的过程包括将DNA压缩成纳米粒、摄取入胞、从内体释放到胞浆中和DNA进入胞核等过程。DNA由于其磷酸基而带有负电, 在足量PEI存在的情况下,DNA会被压缩形成纳米粒, 压缩的强度与聚合物/DNA比例 (一般以N/P比表示) 有关。在通常采用的N/P比例 (> 4) 下,PEI/DNA复合物的ξ电位显电正性, 选 用不同分子质量的PEI时ξ电位无明显差异[23]。PEI与DNA形成纳米粒后, 既能保护DNA不被酶解, 又能促进细胞通过吸附介导的内吞入胞[24]。纳米粒入胞后进入内体,PEI与质子结合, 使得膜上的质子泵持续开放, 导致Cl- 和水的潴留, 引发内体膜的肿胀破裂, 内体中的纳米粒渗漏到细胞质中。因此,PEI的细胞转染效率非常高[25, 26]。Grzelinski等[27]制备了siRNA-PEI复合物, 并用于肿瘤抑制实验。结果显示, 与单纯的siRNA相比, 抗肿瘤效果有明显提高, 且细胞内与siRNA相关的多效生长因子明显下调。

聚酰胺-胺类 [poly(amidoamine)s,PAAs] 和含咪唑的高聚物同样具有较强的内体逃逸性能。PAAs是一类合成的、具有良好生物相容性的可降解水溶性高分子材料。大多数PAAs在pH 5.1~7.4具有很强的pH缓冲能力, 甚至超过PEI, 这说明其处于内体环境中时, 同样能产生质子海绵效应[28]。Kim等[29]合成了多聚天冬氨酸衍生物, 并将其作为血管内皮生长因子 (VEGF) 与细胞凋亡因子 (BCL-2) siRNA的载体, 结果显示: 该复合物转染效率高, 与siRNA相关的VEGF和BCL-2明显下调; 共聚焦扫描显微镜观察到, 24 h后siRNA主要分布在细胞质中。含咪唑的高聚物与PEI一样, 在pH 7.2~5.0时具有缓冲能力, 同样能够通过质子海绵效应破坏内体膜[30, 31]。研究表明, 经咪唑基团修饰的聚合物、纳米粒和脂质体, 能够显著影响内体膜的稳定性, 促进DNA进入细胞质, 提高转染效率, 却不增加细胞毒性[32]。Wen等[33]合成 了组氨酸修饰的树枝状聚合物 (HPG4), 并用这种材料与荧光素酶基因一起制成复合微粒。结果显示, 与PG4复合微粒相比, 转染效率提高了10~100倍。细胞内的分布显示该微粒具有很好的内体逃逸效果。

3 基于膜融合的内体逃逸技术

研究表明, 一些来源于细菌和病毒的多肽和蛋白, 在中性pH (如血浆和胞浆中) 条件下, 不表现出任何膜融合活性, 而在低pH (如内体和溶酶体中) 条件下, 将会发生结构的改变, 从而诱导磷脂双分子层的融合。基于这个原理, 具有磷脂双分子层结构的非病毒基因载体经这类多肽修饰后, 能够使进入内体的基因药物逃逸出来。

膜融合肽是病毒侵染宿主细胞时诱导膜融合的疏水片段, 其中最典型的就是HA-2。HA-2是来源于流感病毒膜融合蛋白HA的一段多肽, 它的氨基末端大约有20个氨基酸残基, 是诱导膜融合的关键部位。当处于中性pH环境中时, 膜融合肽被包埋在三聚体中, 不表现出任何膜融合活性; 当处于内体的酸性pH环境中时,HA的结构发生不可逆的改变, 导致HA-2暴露出来, 并以α-螺旋结构插入到内体膜中。这个新的α-螺旋结构, 将诱导载体膜融合到细胞膜中, 从而使内体中的物质释放出来[34]。以HA-2 N端的氨基酸序列为模型,Tara等[35]设计并合成了KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。当KALA所处环境由pH值中性 (pH 7.0) 向酸性 (pH 5.0) 变化时, 其构型可由随机螺旋转变成α-螺旋。这种结构一面是疏水性的亮氨酸残基, 另一面是亲水性的赖氨酸残基, 其两亲性的特点决定了它与核酸制成复合物后, 既能通过吸附介导的内吞入胞, 又能诱导膜融合促进内体逃逸。当KALA与PEI合并使用, 还可以增强DNA/PEI复合物和DNA/脂质体复合物介导的基因转染效率[36, 37]。依据HA-2 N端变异 (4位谷氨酸转变为甘氨酸) 后的氨基酸序列合成的GALA, 其作用机制与KALA相似, 也是通过诱导膜融合, 实现内体中物质的释放[38]

膜融合肽还有很多, 如流感病毒膜融合肽INF-7、白喉毒素、仙台病毒F蛋白和甜箭肽 (sweet arrow peptide,SAP) 以及生物模拟的人工合成多肽等。这些多肽作为内体逃逸试剂已被广泛研究[39, 40, 41, 42]。EI-Sayed等[43]制备了8个精氨酸修饰的纳米基因载体, 并且在载体中加入INF-7。体外实验结果显示, 与未加INF-7的载体相比, 含有INF-7载体的转染效率提高了95倍。Fernandaz-Carneado等[44]针对甜箭肽的特点, 设计并合成了一种富含脯氨酸的多肽, 并通过载体分子在细胞内分布实验证明了它的内体逃逸性能。

4 基于光化学内化的内体逃逸技术

光化学内化 (photochemical internalization,PCI) 技术是一种利用光激活细胞内吞的附着于内体膜表面的感光性分子, 产生活性氧破坏内体的膜结构, 使内体中的物质有效地释放到胞浆中的技术。基于光化学内化的内体逃逸过程如下[45]: ① 光敏剂和载体复合物一起被输送; ② 光敏剂附着到质膜上, 并和载体复合物通过内吞方式进入细胞; ③ 在没有光照射时, 这些载体复合物最终会被酶水解; ④ 有光照射时, 光敏剂被光激活产生活性氧 (主要是单重态氧), 使内体膜氧化而破裂, 导致内体中物质释放出来。活性氧

寿命短且作用范围有限, 几乎不会影响到细胞内其他细胞器。另外,PCI技术的作用方式主要采用光强度控制, 在光未照射到的区域不产生作用。因此,PCI技术是一种有效可控的内体逃逸方法。

卟啉类衍生物是常用的PCI光敏剂。卟啉 (porphyrins) 是一类由4个吡咯环通过次甲基连成的大环类化合物, 该类化合物具有共同的卟吩核结构。卟吩是由18个原子和18个电子组成的平面芳香性 共轭大分子化合物。卟吩核上的取代基不同, 卟吩环的整体结构变化不大, 但与附近原子之间的相互作用发生改变。卟吩环上的取代基在一定程度上调整卟吩共轭体系中原子电荷的分布, 进而不同程度地改变其光谱学性质[46, 47]。因此, 用不同取代基对卟吩核进行修饰, 以改变其结构、性质与功能, 从而设计出新型的卟啉类的光敏剂。

常用的卟啉类光敏剂有二血卟啉酯 (TPPS2a)、四-(4-磺基苯) 卟啉 (TPPS4)、酞菁类和卟啉单甲醚等。在基因胞内传递的研究中, 这些光敏剂常用于提高基因的内化效率。Oliveira等[48]在表皮生长因子受体干扰RNA脂质体复合物中加入TPPS2a, 结果显示表皮生长因子受体蛋白的量降低了10倍。光化学内化技术可用于多种剂型如脂质体和纳米粒, 而且在一些研究中通过与其他的内体逃逸试剂合用来增加载体从内体中释放。Mellert等[49]将TPPS4与其他的内体逃逸试剂联合使用, 结果证明TPPS4能够提高CPP的内体逃逸效率。

5 结语

细胞内体膜屏障是基因类药物应用的主要障碍, 如何突破膜屏障把目标分子有效地传递到特定细胞器已成为研究的热点。促进内体逃逸是基因药物传递系统中突破膜屏障的一种重要策略。不同的内体逃逸机制有着不同的特征, 其代表的内体逃逸试剂也各不相同。基于致孔机制和膜融合机制的内体逃逸试 剂, 大多数是来源于生物体的多肽, 这类试剂内体逃逸效率高, 但存在着免疫原性的问题。基于质子海绵效应和光化学内化机制的内体逃逸试剂大多是人工合成的化学试剂, 易于生产使用, 无免疫原性, 但与多肽类试剂相比, 存在着效率低、毒性大的问题。理想的内体逃逸试剂应该没有免疫原性、高效、易于生产使用、容易与配体特异性结合、适合大规模生产等。虽然目前的内体逃逸试剂不能完全满足上述要求, 但相信随着研究的深入, 越来越多的内体逃逸试剂将被开发, 内体逃逸试剂必然会在基因胞内传递中得到广泛的应用。

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