药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1124-1129   PDF    
格列卫激活caspase-3诱导K562细胞凋亡
蒲俏虹1,2, 吴清清1,2, 金小宝1,2 , 王伟章1,2     
1. 广东药学院 基础学院, 广东 广州 510006;
2. 广东药学院 广东省生物活性药物研究重点实验室, 广东 广州 510006
摘要:本文主要探讨格列卫诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的分子机制。采用流式细胞术检测格列卫对K562细胞凋亡和细胞周期的影响、caspase泛阻断剂Z-VAD-FMK及沉默PDCD4表达对格列卫诱导K562细胞凋亡的影响;Western blotting分析si-PDCD4对PDCD4蛋白的沉默效果,以及格列卫对caspase-3和PARP蛋白的活化及PDCD4蛋白表达的影响。结果显示,格列卫能显著诱导K562细胞发生凋亡和阻滞于G0/G1期,促进caspase-3和PARP蛋白的活化,上调PDCD4蛋白的表达;Z-VAD-FMK抑制剂显著抑制格列卫诱导的细胞凋亡(47.97% ± 10.56% vs 31.05% ± 9.206%,P < 0.05);si-PDCD4能有效抑制PDCD4蛋白的表达;si-PDCD4沉默PDCD4蛋白表达能部分抑制格列卫诱导的细胞凋亡(46.97% ± 14.32% vs 42.8% ± 11.43%)。综上所述,格列卫通过激活caspase-3诱导K562细胞凋亡。
关键词格列卫     慢性粒细胞白血病     K562细胞     细胞凋亡     caspase-3    
Gleevec induces apoptosis in K562 cells through activating caspase-3
PU Qiao-hong1,2, WU Qing-qing1,2, JIN Xiao-bao1,2 , WANG Wei-zhang1,2     
1. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
2. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
Abstract: The present study is to elucidate the mechanisms underlying Gleevec-induced apoptosis of chronic myeloid leukemia (CML) K562 cells in vitro. The apoptotic cell death and cell cycle distribution after Gleevec treatment and the effect of PDCD4 siRNA on Gleevec-induced apoptosis of K562 cells were analyzed by flow cytometry. The effect of Gleevec on p-Crkl, caspase-3, PARP and PDCD4 protein levels, and the knockdown efficacy of PDCD4 siRNA were detected by Western blotting. The results showed that Gleevec dramatically suppressed the phosphorylation level of Crkl in a dose-dependent manner and induced significant apoptosis and G0/G1 cell cycle arrest of K562 cells in time-and dose-dependent manners. In addition, Gleevec activated caspase-3 and its downstream substrates PARP, and the caspase pan inhibitor Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1) markedly reduced Gleevec-induced apoptosis from 47.97% ± 10.56% to 31.05% ± 9.206% (P < 0.05). Moreover, Gleevec significantly increased the protein expression of programmed cell death 4 (PDCD4). PDCD4 knockdown by siRNA reduced Gleevec-induced apoptosis from 46.97% ± 14.32% to 42.8% ± 11.43%. In summary, Gleevec induced apoptosis in K562 cells via caspase-3 activation.
Key words: Gleevec     chronic myeloid leukemia     K562 cell     apoptosis     caspase-3    

慢性粒细胞白血病 (chronic myeloidleukemia,CML) 是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病,严重地威胁着人类的健康。在95% 的CML患者体内可检测到特征性的Ph染色体,即t (9; 22) (q34; q11),其形成的BCR-ABL基因编码的p210Bcr-Abl蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性,并通过激活一系列的信号通路最终导致CML的产生[1,2,3]。格列卫 (Gleevec; 又称甲磺酸伊马替尼,imatinib mesylate,IM) 是一个以ABL蛋白激酶的结合位点为基础而设计合成的、特异性针对BCR-ABL蛋白的酪氨酸激酶抑制剂[4,5],在慢性期CML患者的临床治疗中取得巨大的成功。体外研究表明,格列卫能有效抑制BCR- ABL+细胞的增殖和诱导细胞凋亡[6,7,8,9],然而,其诱导CML细胞凋亡的分子机制至今尚未完全研究清楚。阐明格列卫诱导BCR-ABL+CML细胞凋亡的分子机制有助于克服格列卫耐药以及开创新的治疗手段。因此,本研究就格列卫诱导K562细胞凋亡的分子机制进行初步的探讨。

材料与方法 材料

K562细胞购自中国科学院上海分院细胞库; RPMI-1640培养液和胎牛血清 (Gibco公司); 二甲基亚砜 (DMSO)、碘化丙啶 (propidium iodide,PI) 及格列卫 (Gleevec) 均购于Sigma公司,溶于DMSO,配成浓度为5 mmol·L-1的母液,使用时稀释至适宜浓度; caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK (Merck公司); Alexa Flour 647 Annexin V细胞凋亡试剂 (Biolegend公司); 10×binding buffer (BD公司); caspase-3、PARP、p-Crkl、c-Abl和PDCD4抗体 (Cell Signaling Technology公司); lipofectamine RNAi MAX转染试剂 (Invitrogen公司); RNase(Sigma公司)。

细胞培养

取K562细胞,培养于含10% 胎牛血清、100 u·mL-1青霉素和链霉素的RPMI-1640培养液中,于5% CO2、37 ℃的恒温条件下进行培养,每3天传代1次,取对数生长期细胞进行实验。

Western blotting分析

终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0及10 μmol·L-1的格列卫处理K562不同时间 (6、24及48 h) 后,收集细胞并提取蛋白,通过BCA试剂盒测定各组的蛋白浓度。样品经SDS- PAGE电泳分离,湿转至硝酸纤维素膜,室温条件下5% 脱脂奶粉封闭2 h,加入含5% BSA稀释液稀释的p-Crkl、c-Abl、caspase-3、PARP、PDCD4、β-actin和Tubulin抗体(1∶2 000),4 ℃过夜,加入稀释的二抗 (1∶5 000),室温孵育1 h。洗膜后用ECL solution显色,最后进行显影,定影。

细胞凋亡检测

以终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0及10 μmol·L-1的格列卫处理K562细胞不同时间 (12、24及48 h) 后,收集细胞; 1×PBS润洗细胞2次,加入1×binding buffer 100 μL,轻轻混匀细 胞,加入Alexa Flour 647 Annexin V试剂5 μL,室 温避光孵育25 min,然后加入PI 5 μL再避光孵育 5 min,最后加入binding buffer至终体积500 μL,上机检测。

细胞周期检测

以终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0及10 μmol·L-1的格列卫处理K562细胞不 同时间 (16、20及24 h) 后,收集细胞,1×PBS润洗细胞2次,-20 ℃预冷70% 乙醇固定过夜。上机前 样品用1×PBS润洗2次,1×PBS 100 μL重悬细胞并 加入RNA酶2 μL,于37 ℃条件下孵育15 min,再以1×PBS润洗,1×PBS 100 μL重悬细胞, 加入PI 5 μL,室温避光孵育5 min,最后加入1×PBS至500 μL体 积,混匀后上机检测。

Z-VAD-FMK抑制实验

溶于DMSO,配制为10 mmol·L-1工作液。取K562细胞,按细胞数2×105/孔接种于24孔板,加入含10% FBS的RPMI-1640培养基1 mL。将配制好的Z-VAD-FMK溶液5 μL加入培养孔中,至终浓度为50 μmol·L-1,处理细胞1 h后,加入适宜浓度的格列卫,混匀后培养箱中培养48 h。

PDCD4 RNAi实验

PDCD4 siRNA由广州锐 博生物科技有限公司合成。取K562细胞,按细胞 数1×105/孔接种于24孔板,加入含10% FBS的RPMI-1640培养基至400 μL体积。将siRNA (终浓 度100 nmol·L-1,1.25 μL) 稀释于opti-MEM 50 μL 中,轻轻混匀; 另外,将lipofectamine RNAi MAX 1 μL稀释于opti-MEM 50 μL中,室温放置5 min后将两种稀释液混合,轻轻混匀; 室温孵育20 min后,将lipofectamine RNAi MAX/siRNA混合液加入培养孔中; 混匀后培养箱中培养48 h,补加10% FBS RPMI- 1640培养基至1 mL,加入终浓度为1.0 μmol·L-1的格列卫处理细胞48 h后,检测细胞凋亡。

统计学处理

使用Prism软件进行数据分析,数据用± s表示。两组间数据比较采用t检验。

结果 1 格列卫对K562细胞的Crkl蛋白磷酸化、细胞凋亡及细胞周期的影响

Western blotting结果显示,格列卫呈浓度依赖性抑制Crkl蛋白的磷酸化,但对Bcr-Abl和C-Abl总蛋白表达无明显影响,表明格列卫能有效抑制Bcr-Abl的酪氨酸激酶活性 (图 1A)。细胞凋亡实验结果显示,随着格列卫处理浓度的升高以及处理时间的延长,K562细胞的凋亡率显著升高 (P < 0.05,P < 0.01,图 1B)。细胞周期实验结果显示,格列卫处理组细胞G0/ G1期所占百分比明显升高 (P < 0.05,P < 0.01,P < 0.001),G2/M期和S期细胞所占比例均减少,说明格列卫诱导K562细胞发生G0/G1期阻滞 (图 1C)。

Figure 1 Effect of Gleevec (imatinib mesylate,IM) on the phosphorylation of Crk1,apoptosis and cell cycle of K562 cells. A: K562 cells were treated with different doses of IM for 6 h and then the Crkl phosphorylation,Bcr-Abl and C-Abl protein expression were evaluated by Western blotting; B: K562 cells were treated with different doses of IM for 12,24 and 48 h and then cell apoptosis was detected by flow cytometry; C: K562 cells were treated with different doses of IM for 16,20 and 24 h and then cell cycle was evaluated by flow cytometry. P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001 vs blank group
2 Caspase-3在格列卫诱导K562细胞凋亡中的作用

正常情况下caspase-3以酶原 (35 kD) 的形式存在于胞浆中,但在凋亡早期会被激活,活化的caspase-3由两个大亚基 (17 kD) 和两个小亚基 (12 kD) 组成,切割相应的胞浆胞核底物PARP,最终导致细胞凋亡。因此,需检测caspase-3及PARP在格列卫诱导后的活化情况。Western blotting的结果显示 (图 2A),不同浓 度的格列卫处理K562细胞24和48 h后,caspase-3和PARP的活性条带出现,表明格列卫诱导了K562细胞中caspase-3蛋白的活化。为进一步验证caspase-3在格列卫诱导凋亡中的作用,使用caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK抑制caspase活性后,检测格列卫诱导K562细胞凋亡的变化。流式细胞仪检测结果显示 (图 2B),Z-VAD-FMK预处理后给予1.0 μmol·L-1格 列卫处理48 h,K562细胞的凋亡明显少于格列卫 单独处理组,细胞凋亡率从47.97% ± 10.56% 下降至31.05% ± 9.206% (P <0.05),提示格列卫通过caspase级联活化caspase-3诱导K562细胞凋亡。

Figure 2 Caspase-3 is required for IM-induced apoptosis of K562 cells. A: K562 cells were treated with different doses of IM for 24 and 48 h,and then the active caspase-3 and PARP protein expression were evaluated by Western blotting; B: K562 cells were treated with Z-VAD-FMK (50 μmol·L-1) for 1 h,followed by treatment with 1.0 μmol·L-1 IM for 48 h,and then the apoptosis was detected by flow cytometry. P < 0.05,**P < 0.01 vs blank group
3 PDCD4在格列卫诱导K562细胞凋亡中的作用

程序性细胞凋亡因子4 (programmed cell death 4,PDCD4) 是抑癌基因,具有促凋亡功能[10]。研究表明,过表达PDCD4能够诱导caspase-3的活化[11]。因此,检测了格列卫处理K562细胞后对PDCD4蛋白的影响。Western blotting结果显示,与对照组相比,格列卫 (2.5及1.0 μmol·L-1) 处理K562细胞24及48 h后,能够明显促进PDCD4蛋白的表达 (图 3)。为了进一步研究PDCD4在格列卫诱导K562细胞凋亡中的作用,通过RNAi方法抑制PDCD4的表达。Western blotting结果显示,针对PDCD4的siRNA可以显著降低K562细胞中PDCD4蛋白的表达 (图 4A)。细胞凋亡检测结果显示 (图 4B),转染PDCD4 siRNA 48 h后给予1.0 μmol·L-1格列卫处理48 h,K562的细胞凋亡有一定减少,细胞凋亡率从46.97% ± 14.32% 下降至42.8% ± 11.43%,表明PDCD4在格列卫诱导K562细胞凋亡过程中具有一定的促进作用。

Figure 3 Gleevec increased protein expression of PDCD4 in K562 cells

Figure 4 Effect of PDCD4 knockdown on IM-induced apoptosis of K562 cells. A: K562 cells were transfected with si-PDCD4 for 48 h,and the PDCD4 protein expression was observed by Western blotting; B: K562 cells transfected with si-PDCD4 for 48 h,followed by treatment with 1.0 μmol·L-1 IM for 48 h,and then the apoptosis detected by flow cytometry. si-NC: si-Negative control
讨论

生物体内各种组织细胞通过增殖与凋亡来维持数量的平衡。一旦这种平衡被打破就会导致一些疾病如癌症的产生。其中肿瘤细胞凋亡的抑制是肿瘤发生的一个重要原因,诱导肿瘤细胞凋亡显然是肿瘤治疗的重要策略之一。由于绝大部分的CML患者白细胞中均含有Ph染色体,Bcr-Abl基因也因此被公认为是CML发病的分子基础[12]。抑制Bcr-Abl的激酶活性是有效控制CML疾病的重要治疗手段。以往的研究已经表明,格列卫等酪氨酸激酶抑制剂能有效抑制Bcr-Abl+CML细胞的生长[7,13],但其具体机制尚不完全清楚。本研究发现,格列卫能够诱导K562细胞发生显著的细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞,这可能是格列卫在体内外抑制CML细胞生长的重要机制。Gobin等[14]研究也发现,格列卫能够诱导MG-63、MOS-J及OSRGA等骨肉瘤细胞株发生细胞凋亡以及G0/G1期细胞周期阻滞,从而抑制骨肉瘤细胞增殖。Cora-Tybor等[15]和Nimmanapalli等[16]也曾报道格列卫能通过抑制Akt激酶和激活NF-κB通路,最终激活caspase途径导致Bcr-Abl+细胞凋亡。

细胞凋亡过程由多种分子参与,凋亡通路主要有: 死亡受体介导的凋亡途径、Bcl-2家族成员介导的线粒体凋亡途径以及内质网应激启动的凋亡途径。其中前两者是经典凋亡途径,最后均通过激活下游的caspase-3促使细胞凋亡[17],而内质网应激途径可以通过激活caspase-12、CHOP或JNK这3条通路 导致细胞凋亡[18,19,20]。在本研究中,格列卫能够明显 地活化K562细胞中的caspase-3和PARP蛋白,并 且抑制caspase家族成员的活性能显著地抑制格列卫诱导的细胞凋亡,提示格列卫是通过caspase级联反应并最终通过激活caspase-3诱导K562细胞的凋亡。

与本报道一致的是,以往一些研究也表明格列卫诱导K562细胞、Ph+细胞凋亡的过程中均显著地活化caspase-3[8,21,22],最近Meng等[23]研究也指出,格列卫在诱导处于巨核危机阶段的CML患者的CD34+细胞群凋亡过程中激活了caspase-3,并呈时间和浓度依赖性。综合这些结果,说明caspase-3在格列卫诱导CML凋亡中发挥着重要的作用。需要指出的是,本实验中阻断caspase通路后格列卫诱导的细胞凋亡并未被完全抑制,提示可能还存在其他的途径调控格列卫诱导K562细胞凋亡。

PDCD4作为近年新发现的一种抑癌基因,最初是在人们研究凋亡细胞时被发现的,被认为是一种凋亡相关的基因。研究表明,PDCD4在大肠癌、神经胶质细胞癌、肝癌、胰腺癌中均存在表达缺失,上 调PDCD4表达能诱导乳腺癌细胞T-47D和MDA- MB-231发生凋亡[24]。最近Ozpolat等[25]研究还显示,PDCD4能够在一定程度上促进维甲酸诱导的髓样白血病细胞中粒细胞的分化; 孔海丽等[26]研究也提示,TGF-β1可能通过调节PDCD4的表达诱导AML细胞凋亡。这些都提示,PDCD4在血液系统肿瘤中也发挥着重要作用。在本实验中,格列卫诱导K562细胞时PDCD4的表达水平显著升高,并且下调PDCD4表达对格列卫诱导凋亡有一定的抑制作用,虽在统计学上无显著差异,但也提示PDCD4可能在格列卫诱导CML细胞凋亡中起一定的调控作用。

格列卫对CML细胞的生存调控机制复杂多样。作者的研究发现,格列卫具有诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用,并且其诱导的细胞凋亡依赖caspase-3,是否存在着其他的调控途径发挥作用有待深入研究。

参考文献
[1] Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining [J]. Nature, 1973, 243: 290-293.
[2] Druker BJ. Translation of the Philadelphia chromosome into therapy for CML [J]. Blood, 2008, 112: 4808-4817.
[3] Horne SD, Steven JB, Abdallah BY, et al. Why imatinib remains an exception of cancer research [J]. J Cell Physiol, 2013, 228: 665-670.
[4] Druker BJ, Tamura S, Buchdunger E, et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells [J]. Nat Med, 1996, 2: 561-566.
[5] Buchdunger E, Zimmermann J, Mett H, et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative [J]. Cancer Res, 1996, 56: 100-104.
[6] le Coutre P, Mologni L, Cleris L, et al. In vivo eradication of human BCR/ABL-positive leukemia cells with an ABL kinase inhibitor [J]. J Natl Cancer Inst, 1999, 91: 163-168.
[7] Deininger MW, Goldman JM, Lydon N, et al. The tyrosine kinase inhibitor CGP57148B selectively inhibits the growth of BCR-ABL-positive cells [J]. Blood, 1997, 90: 3691-3698.
[8] Jacquel A, Herrant M, Legros L, et al. Imatinib induces mitochondria-dependent apoptosis of the Bcr-Abl-positive K562 cell line and its differentiation toward the erythroid lineage [J]. FASEB J, 2003, 17: 2160-2162.
[9] Shao S, Li S, Qin Y, et al. Spautin-1, a novel autophagy inhibitor, enhances imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia [J]. Int J Oncol, 2014, 44: 1661-1668.
[10] Lankat-Buttgereit B, Göke R. The tumour suppressor Pdcd4: recent advances in the elucidation of function and regulation [J]. Biol Cell, 2009, 101: 309-317.
[11] Zhang X, Wang XY, Song XG, et al. Programmed cell death 4 enhances chemosensitivity of ovarian cancer cells by activating death receptor pathway in vitro and in vivo [J]. Cancer Sci, 2010, 101: 2163-2170.
[12] Ren R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia [J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5: 172-183.
[13] Li KN, Jin J, Chen XG. Annexin A1 increases the sensitiv-ity of K562 cell to imatinib [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 866-873.
[14] Gobin B, Moricrau G, Ory B, et al. Imatinib mesylate exerts anti-proliferative effects on osteosarcoma cells and inhibits the tumour growth in immunocompetent murine models [J]. PLoS One, 2014, 9: 90795.
[15] Gora-Tybor J, Deininger MW, Goldman JM, et al. The susceptibility of Philadelphia chromosome positive cells to FAS-mediated apoptosis is not linked to the tyrosine kinase activity of BCR-ABL [J]. Br J Haematol, 1998, 103: 716-720.
[16] Nimmanapalli R, Bhalla K. Novel targeted therapies for Bcr-Abl positive acute leukemias: beyond STI571 [J]. Oncogene, 2002, 21: 8584-8590.
[17] Takeda K, Stagg J, Yagita H, et al. Targeting death-inducing receptors in cancer therapy [J]. Oncogene, 2007, 26: 3745-3757.
[18] Gotoh T, Oyadomari S, Mori K, et al. Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages is mediated by endoplasmic reticulum stress pathway involving ATF6 and CHOP [J]. J Biol Chem, 2002, 277: 12343-12350.
[19] Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta [J]. Nature, 2000, 403: 98-103.
[20] Wang XZ, Harding HP, Zhang Y, et al. Cloning of mammalian Ire1 reveals diversity in the ER stress responses [J]. EMBO J, 1998, 17: 5708-5717.
[21] Wu N, Kurosu T, Oshikawa G, et al. PECAM-1 is involved in BCR/ABL signaling and may downregulate imatinib-induced apoptosis of Philadelphia chromosome positive leukemia cells [J]. Int J Oncol, 2013, 42: 419-428.
[22] Zhang YJ, Lu CR, Cao Y, et al. Imatinib induces H2AX phosphorylation and apoptosis in chronic myelogenous leukemia cells in vitro via caspase-3/Mst1 pathway [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2012, 33: 551-557.
[23] Meng F, Zeng W, Huang L, et al. Effects of imatinib on CD34 cells of patients with chronic myeloid leukemia in the megakaryocytic crisis phase [J]. Oncol Lett, 2014, 7: 791-796.
[24] Afonja O, Juste D, Das S, et al. Induction of PDCD4 tu-mor suppressor gene expression by RAR agonists, antiestrogen and HER-2/neu antagonist in breast cancer cells. Evidence for a role in apoptosis [J]. Oncogene, 2004, 23: 8135-8145.
[25] Ozpolat B, Akar U, Steiner M, et al. Programmed cell death-4 tumor suppressor protein contributes to retinoic ac-id-induced terminal granulocytic differentiation of human myeloid leukemia cells [J]. Mol Cancer Res, 2007, 5: 95-108.
[26] Kong HL, Ma DX, Zhang JJ, et al. Expression and significance of PDCD4 and TGF-β1 in patients with acute myeloid leukemia [J]. J Shandong Univ (山东大学学报), 2011, 49: 110-114.