药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1130-1135   PDF    
消栓通络有效成分组对氧糖剥夺损伤原代培养神经元的保护作用
谢欣梅1, 庞晓斌1 , 赵艳2, 王保全3, 陈若芸4, 杜冠华4     
1. 河南大学药物研究所, 河南 开封 475004;
2. 青岛市市立医院, 山东 青岛 266011;
3. 河南大学淮河临床学院, 河南 开封 475001;
4. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所国家药物筛选中心, 北京 100050
摘要:研究消栓通络有效成分组(XECG) 对原代培养皮质神经元氧糖剥夺(OGD) 损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。采用3日龄SD大鼠皮质制备原代培养神经元;将细胞随机分为正常对照组、OGD模型组和XECG组(1、3及10 mg·L-1);四甲基偶氮唑盐(MTT) 法测定细胞存活率;酶标法试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH) 漏出量;Hoechst染色检测细胞凋亡;RT-PCR检测JAK2、STAT3 mRNA表达变化;Western blotting检测Bcl-2、Bax、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达变化。结果显示,XECG能明显改善OGD对神经元的损伤,提高细胞存活率,减少LDH的释放量,抑制缺氧缺糖引起的细胞凋亡;能提高缺糖缺氧神经元Bcl-2/Bax比值,增加JAK2、STAT3基因和蛋白的表达。以上结果表明,XECG对OGD损伤的原代培养神经元具有明显保护作用,其机制可能与激活JAK2/STAT3通路、影响凋亡相关基因Bcl-2及Bax的表达有关。
关键词消栓通络有效成分组 (XECG)     原代培养神经元     糖氧剥夺     JAK2/STAT3信号通路    
Neuroprotective effects of the effective components group of Xiaoshuantongluo against oxygen-glucose deprivation in primary cultured rat cortical neurons
XIE Xin-mei1, PANG Xiao-bin1 , ZHAO Yan2, WANG Bao-quan3, CHEN Ruo-yun4, DU Guan-hua4     
1. Pharmaceutical Institute, Henan University, Kaifeng 475004, China;
2. Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China;
3. The Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, China;
4. National Centre for Pharmaceutical Screening, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: This study is to investigate the effect of the effective components group of Xiaoshuantongluo (XECG) on neuronal injury induced by oxygen-glucose deprivation (OGD) in primary cortical cultures isolated from SD rat cortex at day 3 and the possible mechanism. Cells were divided into control group, OGD model group and XECG group (1, 3 and 10 mg·L-1). The cell viability was assessed with MTT assay and the LDH release rate was measured by enzyme label kit. The cell apoptosis was analyzed using Hoechst staining. RT-PCR was applied to detect the mRNA levels of JAK2 and STAT3. Western blotting was used to detect the expressions of Bcl-2, Bax, p-JAK2 and p-STAT3 proteins. Results showed that XECG resulted in an obvious resistance to oxygen-glucose deprivation-induced cell apoptosis and decrement of cell viability, decrease the cell LDH release rate. XECG could adjust the expression of Bcl-2 and Bax proteins and increase Bcl-2/Bax ratio, up-regulate the expression of p-JAK2 and p-STAT3. In conclusion, XECG could protect against the neuronal injury cells exposed to OGD, which may be relevant to the promotion of JAK2/STAT3 signaling pathway, and impact the expression of Bax and Bcl-2.
Key words: XECG     primary neuronal culture     oxygen-glucose deprivation     JAK2/STAT3 signaling pathway    

脑中风是目前继心血管疾病、肿瘤之后的全球第三大致死疾病,主要致病原因为脑血管阻塞或狭窄导致脑缺血[1]。消栓通络方出自北京同仁堂传统秘方,由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂共11味中药根据中医药理论配伍而成,具有活血化瘀、温经通络之功效,在中风病的防治中发挥了重要作用。消栓通络有效成分组 (the effective components group of Xiaoshuantongluo,XECG) 是从消栓通络方中经分离提取获得的多种有效成分组合,具有抑制血栓形成,改善脑血流,抑制缺血后的炎症级联反应,抑制血管内皮细胞损伤等功能[2,3,4]

Janus 蛋白酪氨酸激酶 (Janus activated kinase,JAK)-信号传导及转录激活因子 (signal transduction and activators of transcription,STAT) 信号通路是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径,其作用是将细胞外信号传递到细胞核,进而调节细胞核内相关基因转录引发生物学效应[5]。现已证实脑缺血损伤可激活JAKs/STATs信号通路,目前研究表明JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5参与了脑缺血的病理过程,JAK2/STAT3通路是目前的研究重点[6]

为探讨XECG对脑缺血损伤的神经保护作用及其机制,本研究以原代培养的皮质神经元作为研究对象,通过建立氧糖剥夺 (oxygen-glucose deprivation,OGD) 模型模拟中风的缺血再灌注过程,观察XECG的损伤保护作用,探讨其神经保护的分子机制,为进一步发掘XECG的药理作用提供理论依据。

材料与方法 实验动物

72 h内新生Sprague-Dawley (SD) 大鼠,购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室,许可证编号: SCXK (鲁) 2013-0001。

药品与试剂

消栓通络有效成分组 (XECG ,中国医学科学院药物研究所陈若芸研究员提供); 四甲基偶氮唑蓝 (MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)、胰蛋白酶、多聚赖氨酸、Hoechst33342 (美国Sigma公司); DMEM高糖培养基及胎牛血清 (美国Invitrogen公司); 乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase,LDH) 测定试剂盒 (北京化学试剂公司); 小鼠抗人Bcl- 2、Bax,兔抗JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3单克隆抗体 (美国Cell Signal公司); 微管相关蛋白2 (MAP-2) 抗体、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记羊抗兔IgG (北京中杉试剂公司提供); β-actin 抗体和化学发光法 (ECL) 显色试剂盒 (北京康为世纪生物科技有限公司)。

仪器与设备

二氧化碳培养箱 (3432Thermo Fisher Scientific); 三气厌氧培养箱 (美国Thermo公司); 倒置显微镜 (ECLIPSE TS100-F NIKON); 酶标仪 (SUNRISE-BASIC TECAN,Tecan Austria GmbH); 荧光倒置显微镜 (OLYMPUS X71); 凝胶成像系统 (JYO4S-3B,北京君意东方电泳设备有限公司)。

原代皮层神经元的体外培养与鉴定

取72 h内新生SD大鼠10只,75% 乙醇皮肤消毒后,剥离颅骨,暴露脑组织,将皮层组织剪成直径1 mm3大小的组 织块,1∶4加入0.25% 胰蛋白酶,37 ℃消化10 min后加入完全培养基终止消化。用吸管轻轻吹打细胞至 分散 ,过滤,将滤液收集到离心管,置于低温离心机中,4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min。调整细胞数为5×105·mL-1,接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中,置5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。接种至第72 h,加入5 μg·mL-1阿糖胞苷作用24 h,第7天换无阿糖胞苷10% DMEM完全培养基,之后每天换液1次,每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。培养至7~12天即可开始实验。

对上述培养的大鼠原代皮层神经元,于第7天进行神经元特异性标志物MAP-2免疫细胞荧光染色,以鉴定培养物中细胞性质及纯度。用PBS (pH 7.4,37 ℃) 洗涤3次,4% 多聚甲醛固定30 min,Triton X-100作用30 min,再经BSA室温封闭4 h,滴加MAP-2抗体 (1∶200),37 ℃孵育1 h,PBS冲洗,吹干后即由缓冲甘油封固,置荧光显微镜下观察表达阳性的细胞,每张玻片计数10个视野,计算阳性细胞数。

实验分组及OGD模型的制备

取培养的原代皮层神经元细胞,分为5组,分别是正常对照组、OGD模型组、XECG组 (1、3及10 mg·L-1)。正常对照组、OGD模型组换成DMEM培养液,XECG各组换成含相应浓度XECG的DMEM培养液,培养12 h。OGD模型组与XECG各剂量组换为无糖无血清培养基,置三气培养箱内,通入95% N2 + 5% CO2培养1 h,取出换为正常培养液,置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养3 h。正常对照组不作OGD处理。

MTT法检测OGD原代神经元存活率

将原代培养神经元接种于96孔培养板,随机分为5组,分别是正常对照组、OGD模型组、XECG组(1、3及10 mg·L-1),每组6个复孔。OGD处理后分别取出对应的培养板,用MTT法检测。每组实验重复至少3次。

细胞外乳酸脱氢酶 (LDH) 漏出量的测定

各组细胞经OGD处理后,收集细胞培养液,按LDH试剂盒说明书操作,测定LDH含量。

Hoechst染色法观察OGD损伤原代神经元细胞凋亡

取96孔培养板接种原代培养神经元,细胞处理同上,各组细胞经OGD处理后,细胞以PBS洗2次,加入终浓度为10 μg·mL-1的Hoechst 33342,37 ℃、5% CO2细胞培养箱中避光孵育20 min。PBS洗细胞2次,置于荧光显微镜下观察拍照,染色均匀呈淡蓝色的为正常细胞,核染色呈亮蓝色、细胞核不规则者为凋亡细胞。图片采用Image Pro Plus 5.1软件对细胞进行计数并计算其凋亡率。

RT-PCR检测JAK2、STAT3 mRNA水平

应用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用RT-PCR试剂盒扩增JAK2、STAT3基因。JAK2引物序列为: 5'-GG GAAGGTCTTGGAAATA-3',5'-ATGCCTCTGTAAT GTTGG-3',扩增片段543 bp; STAT3引物序列为: 5'- AGTCCAACAACGGTAGCC-3',5'-CCAGACCCAGA ACGAGAA-3',扩增片段为500 bp; β-actin为内参,引物序列为: 5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3',5'- TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3',扩增片段305 bp。

PCR扩增反应条件为: JAK2,94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,40个循环,72 ℃再延伸10 min; STAT3,94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,40个循环,72 ℃再延伸10 min; β-actin基因: 94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,共38个循环。

Western blotting检测Bcl-2、Bax、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达

收集相应处理后的各组细胞,用预冷细胞裂解液裂解,加入蛋白裂解液提取总蛋白。分别取蛋白50 μg加入上样缓冲液,经SDS-PAGE电泳后,电转膜至PVDF膜,室温下5% 脱脂牛奶封闭l h,加入一抗,4 ℃下摇床孵育过夜,TBST洗涤3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液孵育1 h后,ECL法显影、定影,拍照。采用图像分析系统进行显影条带灰度值分析。

统计学分析

实验数据采用SPSS 13.0统计学软件进行分析,数据均以± s表示,组间均数比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 进行t检验。

结果 1 大鼠原代皮层神经元体外培养鉴定结果

图 1所示,神经元培养至7天胞体饱满,突起粗大、分支较多且形成网络,提示神经元生长良好。经鉴定,神经元的纯度为91.16%。

Figure 1 Identification of rat primary cultured cortical neurons (magnification,×400)
2 XECG对OGD损伤原代神经元存活率的影响

结果显示,与正常对照组相比,OGD模型组细胞A值显著降低 (P < 0.01),细胞存活率为40.33% (P < 0.01); XECG可提高细胞的A值 (P < 0.05,P < 0.01),1、3及10 mg·L-1剂量组的细胞存活率分别为72.39%、82.47% 和84.62%,与模型组比较差异显著。见表 1

Table 1 Effect of XECG (the effective components group of Xiaoshuantongluo) on the cell viability under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition detected with MTT assay. n = 6,± s. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group
3 XECG对细胞培养液中LDH漏出量的影响

LDH主要存在于细胞内,细胞破裂时,LDH释放到基质中,故测定LDH含量可以推断细胞损伤程度。OGD处理后,模型组细胞培养液中LDH含量明显升高,与正常对照组比较差异显著 (P < 0.01)。XECG能剂量依赖性地降低细胞培养液中LDH含量,与模型组相比有显著差异 (P < 0.01,P < 0.05)。见图 2

Figure 2 Effect of XECG on OGD-induced LDH release in primary neuron. n = 6,± s. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group
4 XECG对OGD损伤原代神经元的抗凋亡作用

Hoechst染色结果显示,正常对照组细胞呈均匀的蓝色荧光,胞核多为大小较一致、染色均匀的圆形 (图 3A); OGD模型组的荧光强度明显高于正常对照组,细胞核致密浓染、固缩、碎裂 (图 3B); 而XECG各剂量组上述凋亡相关的细胞形态均有不同程度的改善 (图 3C-E)。

Figure 3 Effect of XECG on cell apoptosis of primary neuron induced by OGD. The scanning images show the morphology of cell apoptosis by staining with Hoechst 33342. A: Normal group; B: OGD model group; C: OGD+XECG 1 mg·L-1; D: OGD+XECG 3 mg·L-1; E: OGD+XECG 10 mg·L-1. The histograms show the apoptosis rate of prima ry neuron cells. n = 3,± s. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group

OGD模型组的细胞凋亡率明显高于正常对照组 (P < 0.01),XECG可明显减轻缺氧缺糖导致的细胞凋亡情况,XECG各剂量组细胞凋亡率均低于模型组 (P < 0.05,P < 0.01)。

5 XECG对原代神经元凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

与正常对照组比较,OGD模型组的Bcl-2、Bax蛋白表达均增加,细胞Bcl-2/Bax显著降低 (P < 0.05); 与模型组相比,XECG各剂量组可见Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax增加,差异有统计学意义 (P < 0.05,P < 0.01)。见图 4

Figure 4 Effects of XECG on expression of Bcl-2 and Bax protein measured by Western blotting in primary neuron damaged by OGD. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group
6 XECG对原代神经元JAK2STAT3基因和蛋白表达的影响

RT-PCR结果显示,氧糖剥夺1 h再复氧糖3 h后,模型组神经元JAK2 mRNA水平较对照组明显增加 (P < 0.01); 与模型组相比,XECG各剂量组能明显促进JAK2 mRNA的表达 (P < 0.05,P < 0.01,图 5A); 氧糖剥夺损伤刺激后,STAT3 mRNA表达也明显增加 (P < 0.01); 与模型组相比,XECG各剂量组对STAT3 mRNA的表达均有明显上调作用 (P < 0.05,P < 0.01,图 5B)。

Figure 5 Effect of XECG on expression of JAK2 (A) and STAT3 (B) mRNA determined by RT-PCR in primary neuron damaged by OGD. 1: Control; 2: OGD; 3: OGD+XECG 1 mg·L-1; 4: OGD+XECG 3 mg·L-1; 5: OGD+XECG 10 mg·L-1. n = 3,± s. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group

Western blotting结果显示,氧糖剥夺使原代培养神经元中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量明显高于对照组,差异显著 (P < 0.05,P < 0.05),提示缺氧缺糖激活了JAK2/STAT3信号通路; XECG各剂量组均能促进损伤细胞p-JAK2蛋白表达 (P < 0.05),也明显上调p-STAT3蛋白的表达 (P < 0.05,P < 0.01)。见图 6

Figure 6 Effect of XECG on expression of p-JAK2 (A) and p-STAT3 (B) protein measured by Western blotting in primary neuron damaged by OGD. 1: Control; 2: OGD; 3: OGD+XECG 1 mg·L-1; 4: OGD+XECG 3 mg·L-1; 5: OGD+XECG 10 mg·L-1. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs OGD group
讨论

OGD模型是体外模拟脑缺血最常用的细胞模型,此模型可模拟整体水平脑缺血的许多病理生理特征,对于细胞水平研究缺血性损伤、评价神经保护药物作用及机制都是重要的基本方法[7,8]

XECG是从北京同仁堂传统秘方——消栓通络方中分离获得的多种有效成分组合制剂。研究表明XECG对血管系统和神经细胞具有保护作用[9]。本文通过原代培养的皮质神经元建立OGD模型模拟脑缺血损伤,探讨XECG对缺血缺氧损伤细胞的神经保护作用。研究结果表明,XECG可显著提高氧糖剥夺损伤神经元的细胞存活率,LDH分析和Hoechst染色结果进一步表明,XECG可明显改善OGD诱导的细胞损伤和细胞凋亡的发生。

脑缺血损伤涉及多种病理机制,这些机制紧密联系,互为因果,介导神经元、胶质细胞和血管成分的损伤,最终导致脑细胞凋亡或坏死[10,11]。在凋亡过程中,Bcl-2家族是线粒体引发的Caspase激活通路的主要调节者。Bax与Bcl-2是目前凋亡调控中研究较多的Bcl-2家族成员[12,13]。Bcl-2是一种抗凋亡基因,Bax为促凋亡基因,Bcl-2蛋白和Bax蛋白通过相互结合成为二聚体而发挥凋亡调节作用,当细胞受到促凋亡因素刺激时,两者的比率将决定细胞的存亡。为研究 XECG对脑缺血损伤的作用机制,本实验检测了Bcl-2、Bax 的蛋白表达变化。实验结果显示,OGD损伤后,Bcl-2/Bax比值显著降低,XECG可提高Bcl-2蛋白的表达,抑制Bax蛋白表达的增加,提高Bcl-2/Bax比例。以上结果提示,XECG可能通过上调抗凋亡基因Bcl-2及降低促凋亡基因Bax的表达,提高Bcl-2/Bax,发挥对缺氧细胞的保护作用。

JAK2/STAT3信号通路参与多种细胞因子的细胞内信号转导,广泛参与细胞的增殖、分化、应激、凋亡等多种生理、病理生理过程[14,15]。大量研究表明,脑缺血后释放出的多种细胞因子可以激活JAK2,活化的JAK2进而激活STAT3,STAT3转位至胞核,在核内它们与靶基因启动子中特异的DNA序列结合而诱导目的基因表达[16]。本实验结果表明,皮质神经元经OGD处理后细胞内JAK2、STAT3表达较正常对照组明显增加,XECG各剂量组可显著上调OGD损伤细胞JAK2、STAT3的基因和蛋白表达,说明XECG促进了JAK2-STAT3信号通路的激活,该信号通路的激活与XECG对氧糖剥夺损伤神经元的保护作用密切相关。

STAT3的靶基因包括Bcl-2、survivin、c-fos等 多种与细胞的生长、凋亡和存活有关的基因,目前越来越多的研究认为JAK2/STAT3与脑缺血后细胞凋亡有着密切的关系[17]。有报道指出,STAT3通过JAK- STAT途径增强凋亡抑制基因Bcl-2的表达,抑制外周神经和脊髓内神经细胞的凋亡[18,19]; Ma等[20]研究发现,在某些情况下STAT3则可能通过诱导Bcl-2、Bcl-xL等基因的表达而具有抗细胞凋亡的作用。本实验结果与上述研究报道结果相符,如上所述,XECG可激活JAK2/STAT3通路,并上调抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达,提高Bcl-2/Bax。上述结果提示,XECG可能通过激活JAK2/STAT3信号转导途径,增加p-STAT3蛋白表达,从而上调Bcl-2表达,提高Bcl-2/Bax比 值,发挥对缺氧损伤细胞的保护作用。作者将通过特异性阻断剂AG490阻断JAK2/STAT3信号通路的实验,进一步验证以上结论,揭示XECG对细胞缺氧损伤的保护机制。

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