药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1136-1142   PDF    
苦杏仁苷联合羟基红花黄色素A对IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞的影响
牛凯1,3, 赵永见2,3, 张雷1, 李晨光2,3, 王拥军2,3 , 郑为超1     
1. 安徽理工大学医学院, 安徽 淮南 232001;
2. 上海中医药大学附属龙华医院, 上海 200032;
3. 上海中医药大学脊柱病研究所, 上海 200032
摘要:本文探讨了中药单体苦杏仁苷(amygdalin) 联合羟基红花黄色素A(HSYA) 对IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞的影响,寻找可能的作用机制。从1月龄SD大鼠椎间盘中分离软骨终板并培养软骨终板 细胞,经鉴定后选择第3代软骨终板细胞用于实验,随机分为正常组、诱导组、苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组和联合用药组。采用CCK-8法检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,Real-time PCR(RT-PCR) 检测Aggrecan、Col 2 α1、Col 10 α1、MMP-13、IL-1β mRNA的表达,细胞免疫荧光检测II型胶原、X型胶原的表达。结果表明,与正常组比较,IL-1β诱导组软骨终板细胞增殖降低,细胞凋亡增加(P < 0.05),下调Aggrecan、Col 2 α1 mRNA的表达,上调Col 10 α1、MMP-13、IL-1β mRNA的表达(P < 0.05);同时II型胶原蛋白的表达降低、X型胶原 蛋白的表达升高。与IL-1β诱导组比较,苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组和联合用药组均能在抑制软骨终板细胞凋亡的同时促进软骨终板细胞的增殖(P < 0.05),上调Aggrecan、Col 2 α1 mRNA的表达的同时下调Col 10 α1、MMP-13、IL-1β mRNA的表达(P < 0.05);促进II型胶原蛋白的表达增强、X型胶原蛋白的表达降低。联合用药组作用的效果明显优于苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组(P < 0.05)。苦杏仁苷联合羟基红花黄色素A可抑制IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞发生退变,优于苦杏仁苷、羟基红花黄色素A单独用药。
关键词苦杏仁苷     羟基红花黄色素A     椎间盘     退变     软骨终板    
The synergistic effect of amygdalin and HSYA on the IL-1β induced endplate chondrocytes of rat intervertebral discs
NIU Kai1,3, ZHAO Yong-jian2,3, ZHANG Lei1, LI Chen-guang2,3, WANG Yong-jun2,3 , ZHENG Wei-chao1     
1. Medical College, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001, China;
2. Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China;
3. Institute of Spine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Abstract: The effect of amygdalin joint hydroxysafflor yellow A (HSYA) on the endplate chondrocytes derived from intervertebral discs of rats induced by IL-1β and the possible mechanism were studied and explored. Chondrocytes were obtained from endplate of one-month SD rat intervertebral discs and cultured primary endplate chondrocytes. After identification, they were divided into normal group, induced group, amygdalin group, HSYA group and combined group. CCK-8 kit was adopted to detect the proliferation of the endplate chondrocytes. FCM was measured to detect the apoptosis. Real-time PCR method was adopted to observe the mRNA expression of Aggrecan, Col 2 α1, Col 10 α1, MMP-13 and the inflammatory cytokines IL-1β. The protein expression of Col II, Col X was tested through immunofluorescence. Compared with the normal group, the proliferation of the endplate chondrocytes decreased while the apoptosis increased (P < 0.05). With down regulation of the mRNA expressions of Aggrecan, Col 2 α1 and up regulation of the mRNA expressions of Col 10 α1, MMP-13, IL-1β (P < 0.05), the protein expression of Col II decreased while the protein expression of Col X increased. Compared with the induced group, amygdalin group, HSYA group, the combined group could inhibit the apoptosis and promote the proliferation (P < 0.05). They could increase the mRNA expressions of Aggrecan and Col 2 α1 while decrease the mRNA expressions of Col 10 α1, MMP-13 and IL-1β (P < 0.05). They could also enhance the protein expression of Col II while reduce the protein expression of Col X. The effect of the combined group was significantly better than that of amygdalin and HSYA. Amygdalin joint HSYA could inhibit the degeneration of the endplate chondrocytes derived from intervertebral discs of rats induced by IL-1β and better than the single use of amygdalin or HSYA.
Key words: amygdalin     HSYA     intervertebral disc     degeneration     cartilage endplate    

椎间盘退变 (intervertebral disc degeneration,IVD) 是椎间盘退变性疾病最根本的病理基础,已经成为国际上难治性疾病,严重影响着患者的生活质量。作者前期研究证实IL-1β能够诱导椎间盘软骨终板细胞发生退变,建立了椎间盘炎性退变的细胞模型[1,2]。红花单体羟基红花黄色素A (hydroxysafflor yellow A,HSYA) 能拮抗IL-1β诱导的椎间盘软骨终板细胞凋亡的作用,具有治疗椎间盘退行性疾病的潜能[3]。一定浓度的桃仁单体苦杏仁苷 (amygdalin) 能抑制IL-1β诱导的椎间盘软骨终板细胞发生退变,起到延缓椎间盘退变的作用[4]。该实验研究主要探讨苦杏仁苷联合HSYA对IL-1β诱导退变的椎间盘软骨终板细胞的作用[5]

材料与方法 动物

健康1月龄SPF级SD大鼠,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证编号: SCXK (沪) 2012-0002。

试剂

盐酸氯胺酮注射液 (批号: H35020148,福建古田药业有限公司); Rat IL-1β粉剂 (100991-1 B0911,上海祥弘生物科技有限公司); 羟基红花黄色素A (HSYA,20120816,上海永恒生物科技有限公司); 苦杏仁苷 (amygdalin,050M7007V),Trizol (美国Sigma公司); 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)、DMEM培养基 (美国Gibco公司); Takara逆转录试剂盒 (大连宝生物工程有限公司); 多克隆兔抗II型胶原 (Col II) 抗体、X型胶原 (Col X) 抗体 (BA0533,BA2023,武汉博士德生物工程有限公司); 荧光二抗、DAPI (美国KPL公司); 0.25% 胰蛋白酶 (美国Promega公司); 多聚甲醛、甲苯胺蓝染液 (国药集团化学试剂有限公司)。

仪器

Varioskan Flash全波长扫描多功能读数仪 (美国Thermo公司); 倒置显微镜、倒置荧光显微镜 (日本Olympus公司); 紫外可见光分光光度计 (DU800/ VIS型,美国Beckman公司); 荧光实时定量PCR仪 (C1000 Thermal cycler型,新加坡); 基因R扩增仪 (Mastercycler Personal型,德国Eppendorf公司)。

大鼠椎间盘软骨终板细胞的分离、培养

盐酸 氯胺酮注射液 (4 mL·kg-1) 注入1月龄SD大鼠腹 腔致死,在无菌条件下剪开大鼠背部皮肤,取出椎间盘,放入无菌的PBS中,去除表面污渍,接着用剪刀将其附着组织清除,取软骨终板,将其剪碎,用0.2% 胰蛋白酶在37 ℃培养箱内消化20 min。接着用10% FBS、含1% 青霉素/链霉素的DMEM培养。将培养皿置于37 ℃培养箱 (5% CO2) 内。每隔两天更换1次10% FBS,取长至80% 以上的第3代软骨终板细胞进行实验。

大鼠椎间盘软骨终板细胞的鉴定

细胞爬片成功后,去除培养液,用4% 多聚甲醛固定细胞15 min,PBS冲洗3次,滴0.1% 甲苯胺蓝染色30 min,PBS 冲洗数秒。另在4% 多聚甲醛固定15 min后,室温消化 (0.1% CaCl2+0.1% tripsion) 10 min,PBS漂洗2次,1% BSA封闭30 min,再加入1% BSA稀释的II型胶原一抗 (1∶200稀释),4 ℃过夜。PBS漂洗2次,加入荧光二抗,37 ℃杂交1 h,PBS漂洗2次,镜下观察并照相记录。

实验分组

实验各组细胞长至80%,更换无血清培养基,过夜 (12~16 h) 后分为5组。正常组: 0.5% FBS的DMEM; IL-1β诱导组: 0.5% FBS、10 µg·L-1 IL-1β的DMEM; 苦杏仁苷组: 0.5% FBS、10 µg·L-1 IL-1β、1×10-4 mol·L-1 amygdalin的DMEM; 羟基红花黄色素A组: 0.5% FBS、10 µg·L-1 IL-1β、1×10-5 mol·L-1 HSYA的DMEM; 联合用药组: 0.5% FBS、 10 µg·L-1 IL-1β、1×10-4 mol·L-1 amygdalin、1×10-5 mol·L-1 HSYA的DMEM。

CCK-8法检测大鼠椎间盘软骨终板细胞的增殖

软骨终板细胞以细胞数8 000/孔接种于96孔酶标板中,设立空白组。各组加入相应的培养液,每孔100 µL,培养0、12、24和48 h。在培养的各个时间点,每孔内加入新配制的CCK-8溶液10 µL,置于37 ℃孵育箱 2 h后,用酶标仪检测光密度值 (OD,波长450 nm)。

流式检测细胞凋亡

细胞数10 000个接种于6孔板,培养3天后,长至80% 以上,更换无血清培养基,过夜 (12~16 h) 后,各实验组分别加入相应的培养液,再培养24 h,将培养液收集于15 mL离心管,胰蛋白酶消化,终止反应后将其收集于离心管,再用PBS清洗各孔,将清洗的PBS收集于离心管,接着 以1 500 r·min-1离心5 min,弃上清液,预冷PBS重悬,弃上清液,重复2次,用FITC结合液重悬,将重悬液移至1.5 mL离心管,避光加入FITC,30 min后加入PI 5 min,接着上机检测。

Real-time PCR检测 细胞总RNA提取

将Trizol液1 mL加入6 孔板中,吹打混匀,加入氯仿200 µL。12 000 r·min-1、4 ℃下离心15 min,取上清液,加入等体积预冷的异丙醇,12 000 r·min-1、4 ℃下离心10 min,加入含75% 乙醇、0.1% DEPC水1 mL并混匀,清洗RNA沉淀,12 000 r·min-1、4 ℃下离心10 min,弃上清液,用 30 µL无菌DEPC水处理过的三蒸水溶解沉淀。

RNA逆转录成cDNA

按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。

引物设计

引物由GeneBank数据库中检索,委托北京华大基因公司设计合成,引物序列见表 1

Table 1 The primer sequence
PCR反应

反应体系20 µL,SYBR Premix Ex Taq 10 µL,去离子水7 µL,上下游引物各1 µL,模板cDNA 1 µL。反应过程如下: 95 ℃预变性3 min,进入循环,在95 ℃变性10 s,退火5 s,延伸1 min,循环次数均为40次。以β-actin作为内参,将所得Ct值按2-ΔΔct的方法进行处理。

细胞免疫荧光检测分析Col IICol X的表达

设空白对照组,细胞传代至载玻片,弃培养液,用4% 多聚甲醛固定15 min,室温消化 (0.1% CaCl2 + 0.1% tripsion) 10 min,PBS漂洗2次,1% BSA封闭30 min,再加入1% BSA稀释的Col II、Col X一抗(1∶200稀释),4 ℃过夜。PBS漂洗2次,加入含DAPI的荧 光二抗 (1∶400稀释),37 ℃避光杂交1 h,PBS漂洗 2次,镜下观察并照相记录。

统计学方法

用SPSS18.0统计软件进行数据分析,计量资料均以± s表示,各组间差异显著性检验用单因素方差分析 (one-way ANOVA),P < 0.05差异性有统计学意义。

结果 1 大鼠椎间盘软骨终板细胞的鉴定

大鼠椎间盘软骨终板细胞的鉴定采用了甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光,结果显示,软骨细胞基质中分泌合成的蛋白多糖染成蓝色,细胞基质中分泌合成的Ⅱ型胶原呈绿色发光,说明培养的细胞维持了软骨细胞原有的表型,为实验所需的细胞 (图 1)。

Figure 1 The identification of the endplate chondrocytes in rat intervertebral discs (×200). A: Endplate chondrocytes by toluidine blue staining; B: Expression of Col II in endplate chondrocytes by immunofluorescence
2 大鼠椎间盘软骨终板细胞的增殖

以正常组软骨终板细胞在各时间点的增殖为基准。0 h时各组增殖情况与正常组OD450 nm值相比无明显差异; 12 h时联合用药组软骨终板细胞的增殖高于诱导组。24 h时诱导组软骨终板细胞的增殖与正常组相比明显下降,而苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组及联合用药组软骨终板细胞的增殖明显高于诱导组,与联合用药组比较,苦杏仁苷组和羟基红花黄色素A组软骨终板细胞的增殖较低; 48 h时诱导组软骨终板细胞的增殖有所增加,但略低于正常组 (表 2)。

Table 2 The proliferation of endplate chondrocytes. n = 3,± s. P < 0.05 vs induced group; #P < 0.05 vs combined group. HSYA: Hydroxysafflor yellow A
3 细胞凋亡

流式分析显示,用药培养24 h后诱导组细胞凋亡比例明显高于正常组。与诱导组相比,苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组及联合用药组软骨终板细胞的凋亡比例均明显低于诱导组,同时也低于正常组。与联合用药组比较,苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组软骨终板细胞的凋亡比例较高。联合用药组明显优于苦杏仁苷、羟基红花黄色素A单独用药组 (表 3,图 2)。

Table 3 The rate of cell apoptosis detected by FCM after cultured 24 h. n = 3,± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs induced group; #P < 0.05,##P < 0.01 vs combined group

Figure 2 The proportion of apoptosis assayed by flow cytometry. A: Normal group; B: Induced group; C: Amygdalin group; D: HSYA group; E: Combined group
4 大鼠椎间盘软骨终板细胞AggrecanCol 2 α1Col 10 α1MMP-13、IL-1β mRNA的表达

大鼠椎间盘软骨终板细胞给药培养24 h后,IL-1β诱导组软骨终板细胞Aggrecan、Col 2 α1 mRNA的 表达明显降低,Col 10 α1、MMP-13、IL-1β mRNA的表达明显升高,各组间比较有显著性差异 (P < 0.05)。苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组及联合用药组均能明显上调Aggrecan、Col 2 α1 mRNA的表达,下调Col 10 α1、MMP-13、IL-1β mRNA的表达,各组间比较有显著性差异 (P < 0.05)。联合用药组作用的效果明显优于苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组 (图 3)。

Figure 3 The expression of Aggrecan,Col 2 α1,Col 10 α1,MMP-13 and IL-1β in the endplate chondrocytes. n = 3,± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs induced group; P < 0.05,△△P < 0.01 vs combined group
5 细胞免疫荧光检测Col II、Col X的表达

IL-1β诱导组软骨终板细胞内Col II的表达减弱 (图 4A),Col X的表达增强 (图 4B)。给药培养24 h 后,苦杏仁苷组、羟基红花黄色素A组及联合用药组均能增强Col II的表达、减弱Col X的表达。联合用药组的作用效果略优于苦杏仁苷、羟基红花黄色素A单独用药组。

Figure 4 The expression of Col II (A),Col X (B) detected by immunofluorescent staining (×200) the nuclear of the endplate chondrocytes was stained blue,in cytoplasm the positive of the endplate chondrocytes was stained green fluorescent (DAPI stained nuclear,labeled the cells,yellow arrows point type II collagenpositive and red arrows point type X collagen positive)
讨论

椎间盘是人体内无血供的组织,软骨终板处于椎间盘上、下椎体间,是椎间盘结构和功能的重要组成部分。椎间盘营养供给和代谢的途径主要是软骨 终板的途径,软骨终板细胞的凋亡、退变,可直接影响着椎间盘的退变[6]。早期研究证实退变的软骨终板细胞高表达炎症因子IL-1β等。IL-1β的高表达不仅 会造成软骨终板细胞外基质代谢的失衡,还能够引起椎间盘软骨终板细胞内其他相关炎症因子的高表达,加速和促进椎间盘的退变[7,8]。Col II和蛋白多聚糖 (aggrecan) 是椎间盘软骨终板细胞基质中的主要成分。正常椎间盘软骨终板细胞内Col II的表达,不仅能够调控成软骨基因等表达,还可以依赖性的增加软骨细胞外的基质[9,10,11]。在退变的椎间盘软骨终板细胞内,它们的表达是明显降低的[12,13]。Col X在退变软骨细胞中的表达是明显升高的,Col X的高表达提示软骨细胞的肥大化,这对软骨细胞的改变实际

上是一个持续性的刺激,更能促进椎间盘软骨细胞的退变。基质金属蛋白酶 (matrix metalloprotelmase,MMPs) 在维持软骨细胞外基质 (extracellular matrix,ECM) 的合成和降解的动态平衡中发挥着至关重要的作用,它几乎能够降解全部ECM的成分,同时激活其他类别的MMPs,形成瀑布效应。MMPs中的MMP-13是明胶酶中的一个非常重要的元素,它可以加速和促进Col II进一步裂解,同时对其他类型的胶原、明胶蛋白等细胞外基质中小分子成分均有降解作用。因此,MMP-13的变化最能反映出软骨细胞外基质中成分的合成与代谢的情况[14,15,16]

在前期的研究中,作者发现1×10-5 mol·L-1 HSYA和1×10-4 mol·L-1苦杏仁苷都能够延缓IL-1β诱导 椎间盘软骨终板细胞退变的发生,表明桃仁、红花 各自的单体对椎间盘的生理环境等有一定的影响,对椎间盘细胞有保护作用,起到延缓椎间盘退变的作用。实验研究表明,1×10-4 mol·L-1苦杏仁苷联合1×10-5 mol·L-1 HSYA作用于IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞,对软骨终板细胞不但没有毒性作用,反而能够促进软骨终板细胞的增殖,抑制软骨终板细胞的凋亡。与诱导组相比,其他各组均能明显上调IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞Aggrecan、Col 2 α1 mRNA的表达,下调IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞Col 10 α1、MMP-13及炎症因子IL-1β mRNA的表达,同时增强IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞内Col II蛋白的表达,降低Col X蛋白的表达。鉴于中药复方制剂 成分及体内代谢极为复杂,作者通过药物单体干预IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨终板细胞,避免了中药复方在体内代谢过程中带来的损失,也从整体上模拟了药物作用的过程[17,18]。实验结果表明,联合用药组的作用效果明显优于苦杏仁苷组和羟基红花黄色素A组,与中药复方优于单味药的传统中医药理论相一致。该实验结果证实了苦杏仁苷、HSYA能够延缓椎间盘的退变,也说明了苦杏仁苷联合HSYA能够延缓椎间盘的退变,从另一个侧面说明了桃仁、红花单体的联合用药优于各单体单独用药。

综上所述,本实验研究通过采用IL-1β培养椎间盘软骨终板细胞,建立椎间盘软骨终板细胞炎性退变的细胞模型。结果表明,苦杏仁苷联合HSYA延缓椎间盘退变的作用明显优于单独用药,可能与两药的药理作用具有协同性有关。

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