药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1143-1149   PDF    
新型4-取代-3-硝基苯甲酰胺类似物的设计、合成及活性研究
朱齐凤, 龚永祥, 钟金清, 刘礼飞, 李旭飞, 赵旭阳     
浙江海正药业股份有限公司, 浙江 台州 318000
摘要:本文设计合成了系列新型4-取代-3-硝基苯甲酰胺类化合物,并通过1H NMR、13C NMR、MS及元 素分析确证了目标化合物的结构。以HCT-116、MDA-MB435及HL-60三种细胞株为活性筛选对象,利用SRB法进行初步体外抗肿瘤活性研究。结果表明,大部分化合物对于所试验的癌细胞的增殖都有一定程度的抑制作用,其中化合物4a对3种癌细胞的抗增殖作用最显著,GI50为1.904~2.111 μmol·L-1;化合物4g4l4n对MDA-MB435和HL-60的抑制活性较强,其GI50值分别为1.008~3.586 μmol·L-1和1.993~3.778 μmol·L-1,在此基础上初步探讨了此类化合物的构效关系。
关键词4-取代-3-硝基苯甲酰胺     合成     抗肿瘤活性     构效关系    
Design, synthesis and biological evaluation of novel 4-substituted-3-nitrobenzamide derivatives
ZHU Qi-feng, GONG Yong-xiang, ZHONG Jin-qing, LIU Li-fei, LI Xu-fei, ZHAO Xu-yang     
Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China
Abstract: A series of novel 4-substituted-3-nitrobenzamide derivatives were designed and synthesized. The structures of the target compounds were confirmed with 1H NMR, 13C NMR, MS and element analysis. Anti-tumor activities against HCT-116, MDA-MB435 and HL-60 cell lines in vitro were evaluated by SRB assay. The results indicated most of the target compounds exhibited potent anti-tumor activity. Compound 4a showed the most potent inhibitory activities against three cancer cell lines with the GI50 values of 1.904-2.111 μmol·L-1. Compounds 4g, 4l-4n exhibited more potent inhibitory activities against MDA-MB435 and HL-60 cell lines with the GI50 values of 1.008-3.586 μmol·L-1 and 1.993-3.778 μmol·L-1, respectively. The structure-activity relationship of these compounds is discussed preliminarily.
Key words: 4-substituted-3-nitrobenzamide     synthesis     anti-tumor activity     structure-activity relationship    

癌症是一种严重威胁着人类健康和生命的疾病,全世界每年新发癌症达1 000万,死于癌症者600万以上。癌症由于其独特性质,包括不可控的细胞增殖导致恶性组织不受调控的生长、侵袭局部甚至远隔组织的能力、缺乏分化、缺乏可检测到的症状、缺乏有效的防治手段等,对现代医学提出了严峻考验。通过全世界科学家的努力,市场上已有许多抗癌药物,而且抗癌新药不断出现。虽然如此,但是许多常见实体瘤仍缺乏有效药物,且不少抗癌药物在临床应用过程中产生了耐药性和毒副作用。因此研发活性更高且毒副作用更小的新型抗肿瘤药物势在必行。

据报道芳香族硝基、亚硝基化合物[1,2]和苯甲酰胺类化合物[3,4,5,6]均具有很好的抗肿瘤活性。目前,以芳香硝基、亚硝基和苯甲酰胺为母体的抗肿瘤活性化合物的研究已备受关注[7,8,9]。此类结构中最具代表性的药物为抗乳腺癌药物iniparib[10,11],其II期临床试验结果显示与标准化疗药物联合使用可以使患者整体存活期延长至12.3个月,比化疗药物组延长5个月[12]。关于iniparib的作用机制,最新研究[13,14]显示iniparib不能抑制聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 的活性,不是一个PARP抑制剂,但它可以改变肿瘤细胞中含半胱氨酸的蛋白,从而诱导肿瘤细胞凋亡。

从分子结构上分析,iniparib中含有碘 (图 1),已知含碘有机物对光和空气非常敏感,不稳定,水溶性较差。鉴于生物活性分子中引入不饱和基团(如双键、叁键、氰基、苯基、芳杂环基等) 可改变分子的电性、立体化学性质、分子构型和构象等,从而影响药物的生物活性、代谢以及毒性[15,16],同时不饱和叁键 (炔基) 的吸电子效应、电子云形状均与碘原子相似,且氰基是卤素的生物电子等排体。本文对iniparib进行结构改造和修饰,保留了其维持高活性的苯甲酰胺和芳香硝基的骨架,用不饱和叁键 (炔基、氰基) 替代芳环上的碘,同时在苯甲酰胺的N上引入不同的取代基 (图 1),设计并合成了21个4-取代-3-硝基苯甲酰胺衍生物 (表 1)。

Figure 1 Structure of iniparib and target compounds

Table 1 Structure and inhibitory activities against human tumor cell lines of target compounds

目标化合物的合成以4-碘-3-硝基苯甲酸 (1) 为原料,按照两条路线 (合成路线1和合成路线2) 合成目标化合物。两条路线的主要区别在于引入叁键 (炔基、氰基) 和酰胺取代基的先后顺序不同。合成路线1先引入叁键 (炔基、氰基) 再引入酰胺取代基,如合成化合物4a4h (表 1),其中化合物4d4h由化合物4a的酰胺N-H进一步取代得到; 合成路线2则先引入酰胺取代基再引入叁键 (炔基、氰基),如合成化合物4i4u (表 1)。其中,炔基通过Sonogashira偶合反应引入,即卤代芳烃与炔烃在催化剂 [Pd(PPh3)2Cl2/CuI] 和碱 (Et3N) 的作用下,在THF溶剂中反应得到[17,18]

Scheme 1 Synthesis of compounds 4a-4h. Reagents and conditions: i) K2CO3/MeI,MeCN,40 ℃; ii) a: R1Si(CH3)3,PdCl2(PPh3)2/ Et3N/CuI; b: TBAF/THF; iii) CuR1,HMPA,100 ℃,1 h; iv) NH3/MeOH; v) R3X,NaH,0 ℃

Scheme 2 Synthesis of compounds 4i-4u. Reagents and conditions: i) a: SOCl2/DMF,b: R2R3NH; ii) a: R1Si(CH3)3,PdCl2(PPh3)2/ Et3N/CuI; b: KF/MeOH; iii) CuR1,HMPA,100 ℃,40 min

化合物活性测定采用SRB显色法,以iniparib为阳性对照药,选用人结肠癌HCT-116细胞、人乳腺癌MDA-MB435细胞和人白血病HL-60细胞为实验对象,测试了化合物对不同癌细胞的体外抗增殖活性,并初步探讨了此类化合物的构效关系。

结果与讨论 1 化学部分

目标化合物的结构经1H NMR、13C NMR、ESI-MS及元素分析得以确证,产物的收率见表 1,波谱数据见表 2

Table 2 Spectra dataof target compounds
2 活性评价

以人结肠癌HCT-116细胞、人乳腺癌MDA-MB435细胞及人白血病HL-60细胞为实验对象,iniparib为阳性对照药,采用SRB显色法对目标化合物进行体外活性测定,实验结果见表 1

表 1数据可知,所有目标化合物对MDA-MB435肿瘤细胞的抗增殖作用强于阳性药iniparib; 除4t4u外,大部分目标化合物对HCT-116和HL-60肿瘤细胞的抗增殖作用强于阳性药iniparib。目标化合物中有8个化合物对HCT-116的抑制活性达到微摩尔水平,GI50为1.904~9.987 µmol·L-1; 有13个化合物对MDA-MB435抑制活性达到微摩尔水平,GI50为1.008~8.879 µmol·L-1; 有16个化合物对HL-60抑制活性达到微摩尔水平,GI50为1.993~9.707 µmol·L-1

在所有筛选的化合物中,化合物4a4e4j4k4o4q对3种癌细胞均具有较好的抗增殖作用,GI50值均小于10.0 µmol·L-1,特别是化合物4a对3种癌细胞的抑制活性最强,GI50在2.0 µmol·L-1左右; 化合物4e4g4j4n对MDA-MB435和HL-60的抑制活性较强,GI50值均小于5.0 µmol·L-1; 化合物4d4s对HL-60的抑制活性较强,GI50在2.0~3.0 µmol·L-1

3 构效关系分析

总体来看,4-取代-3-硝基苯甲酰胺衍生物对癌细胞具有一定程度的抗增殖作用。由表 1可知: 所有目标化合物对MDA-MB435肿瘤细胞的抗增殖作用显著; 大部分目标化合物对HCT-116和HL-60肿瘤细胞的抗增殖作用较为显著,但含丙炔基化合物4t和含氰基化合物4u对这两种细胞的抑制活性不明显。

苯环4-位取代R1对活性的影响: R1为乙炔基的化合物 (如化合物4a4i) 对肿瘤细胞的抗增殖作用比R1为丙炔基 (如化合物4b4t) 或氰基 (如化合物4c4u) 的化合物强。其中化合物4a对3种肿瘤细胞的GI50值为1.904~2.111 µmol·L-1,但化合物4b4c对3种肿瘤细胞的GI50值均大于10 µmol·L-1。化合物4t4u对HCT-116和HL-60肿瘤细胞抗增殖作用不明显 (GI50 > 50 µmol·L-1) ,但化合物4i对3种 肿瘤细胞的抑制作用较为显著,特别对MDA-MB435和HL-60的GI50值小于10 µmol·L-1

苯甲酰胺N取代R2和R3对活性的影响: ① R2、R3取代(烷氧羰基、羰基、烷基取代) 后,与酰胺N-H未被取代的化合物 (如化合物4a,R2=R3=H) 相比,大部分化合物 (如化合物4d4s) 对癌细胞的抗增殖作用减弱; ② R2、R3为烷基取代时,双取代化合物 (如化合物4l4n) 比单取代化合物 (如化合物4i4k) 对MDA-MB435和HL-60的抗增殖作用增强; ③ R2、R3为烷基取代时,乙基取代化合物 (如化合物4j4m) 对癌细胞的GI50值低于其他烷基取代化合物 (如化合物4i4k4l4n),表明乙基的引入提高了化合物的抗增殖活性。

本研究结果为该类化合物的设计提供了参考依据,具有一定的指导意义,由于本文所涉及的化合物数量有限且结构类型相对单一,讨论构效关系的样本数还不是很充足,因此构效关系的讨论还有待进一步研究。

实验部分

NMR用Bruker Avance 400型核磁共振仪测定 (TMS为内标,DMSO-d6为溶剂); 液质联用 (ESI-MS) 采用Agilent-1100-LCQ-Advantage质谱仪; RPMI-1640或DMEM培养基、小牛血清 (FBS) 和L-谷氨酰胺均购于GIBCO (Grand Island,NY,USA) 公司; SRB购于Sigma公司。活性测试所用细胞系购自American Type Culture Collection (ATCC)。薄层色谱硅胶GF254、硅胶H为青岛海洋化工有限公司生产; 其余试剂均为分析纯。

1 化学合成 1.1 4-碘-3-硝基苯甲酸甲酯 (2) 的合成

在反应瓶中分别加入55 g (0.19 mol) 4-碘-3-硝基苯甲酸 (1)、16.5 g (0.12 mol) 碳酸钾和550 mL乙腈,搅拌溶解,降温至0~5 ℃,加入52.9 mL (0.38 mol) 三乙胺和71 mL (1.12 mol) 碘甲烷,然后加热至40 ℃左右反应8 h,TLC检测反应完毕后,减压浓缩蒸去大部分乙腈。然后用500 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至少量,加入300 m L石油醚,搅拌30 min后过滤,滤饼烘干得4-碘-3-硝基苯甲酸甲酯 (2),约41.2 g (0.13 mol),收率71.5%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 3.91 (s,3H),7.87 (dd,1H,J = 8.08,1.88 Hz),8.26 (d,1H,J = 8.12 Hz),8.34 (d,1H,J = 9.12 Hz); MS (m/z): 308 [M+H]+

1.2 4-乙炔基-3-硝基苯甲酸甲酯 (3a) 的合成

步骤一: 在反应瓶中加入25 g(0.08 mol) 4-碘-3-硝基苯甲酸甲酯 (2)、20 mL (0.14 mol) 三乙胺和200 mL四氢呋喃,氮气保护,搅拌溶解, 然后加入2.4 g (3.4 mmol) 双 (三苯基磷) 二氯化钯、0.65 g (3.4 mmol) 碘化亚铜和13.7 mL (0.096 mol) 三甲基硅乙炔,室温反应 1 h,减压浓缩蒸去大部分四氢呋喃,加入300 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱色谱分离得产物15.1 g (0.055 mol),收率66.9%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 0.09 (s,9H),3.74 (s,3H),7.69 (d,1H,J = 8.08 Hz),8.00 (dd,1H,J = 8.08,1.52 Hz),8.30 (d,1H,J = 1.36 Hz); MS (m/z): 278 [M+H]+

步骤二: 在反应瓶中加入步骤一所得产物15 g和225 mL四氢呋喃,搅拌,降温至 -25~-20 ℃,然后滴加含7.1 g(0.027 mol) 四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液35 mL,滴毕后继续反应20 min。TLC检测反应完毕后,加入0.5 mol·L-1盐酸调pH至4~5,减压浓缩蒸去大部分四氢呋喃,然后用300 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干得粗产物约10.5 g,柱色谱分离得到4-乙炔基-3-硝基苯甲酸甲酯 (3a) 7.3 g (0.036 mol),收率65.8%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 3.93 (s,3H),5.02 (s,1H),7.93 (d,1H,J = 8.08 Hz),8.21 (dd,1H,J = 8.08,1.64 Hz),8.50 (d,1H,J = 1.48 Hz); MS (m/z): 206 [M+H]+

类似方法合成化合物3b

1.3 4-氰基-3-硝基苯甲酸甲酯 (3c) 的合成

在反应瓶中加入5 g(0.016 mol) 4-碘-3-硝基苯甲酸甲酯 (2)、1.77 g (0.02 mol) 氰化亚铜和15 mL六甲基磷酰三胺 (HMPA),加热至100 ℃反应1 h,反应完毕,冷却至室温,然后用100 mL乙酸乙酯萃取,有机层用水洗涤3次,无水硫酸钠干燥,过滤,将滤液浓缩至干,柱色谱分离得4-氰基-3-硝基苯甲酸甲酯 (3c) 2.7 g (0.013 mol),收率80.4%。1H NMR (400 MHz,DMSO- d6): δ 3.96 (s,3H),8.34 (d,1H,J = 7.9 Hz),8.42 (d,1H,J = 7.7 Hz),8.68 (s,1H); MS (m/z): 229 [M+Na]+

1.4 4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4a) 的合成

在反应瓶中加入7.3 g(0.036 mol) 4-乙炔基-3-硝基苯甲酸甲酯 (3a)、300 mL甲醇和200 mL四氢呋喃,搅拌,通氨气1 h。然后室温反应24 h,TLC检测反应完毕,减 压浓缩蒸去大部分四氢呋喃及甲醇,然后用300 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱色谱分离得4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4a)。

分别以化合物3b3c为原料按类似方法合成化合物4b4c

1.5 N-甲氧羰基-4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4d) 的合成

在反应瓶中加入3 g(0.016 mol) 4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4a)、45 mL四氢呋喃和6 mL氯甲酸甲酯,搅拌溶解,降温至 -10 ℃,加入7.5 g氢化钠,保持在0 ℃左右反应30 min,反应完毕后,将反应液倒入碎冰中,用盐酸调pH至酸性,然后用200 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干得粗产物约3.5 g,柱色谱分离得N-甲氧羰基- 4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4d)。

类似方法合成化合物4e4h,化合物波谱数据见表 2

1.6 N-甲基-4--3-硝基苯甲酰胺 (5i) 的合成

在反应瓶中加入10 g (0.034 mol) 4-碘-3-硝基苯甲酸 (1) 和50 mL N,N-二甲基甲酰胺,搅拌溶解,降温至10 ℃以下,加入7.5 mL (0.10 mol) 氯化亚砜,滴毕升至室温反应1 h,将反应液倒入冷却的200 mL 30% 甲胺 水溶液中,搅拌5 min,析出固体,再加入500 mL冰水,搅拌10 min,过滤,水洗,烘干得到N-甲基-4-碘- 3-硝基苯甲酰胺 (5i) 6.5 g (0.021 mol),收率62.3%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 2.81 (d,3H,J = 4.1 Hz),7.84 (d,1H,J = 7.8 Hz),8.23 (d,1H,J = 8.1 Hz),8.33 (s,1H),8.75 (s,1H); MS (m/z): 307 [M+H]+。类似方法合成化合物5j5u

1.7 N-甲基-4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4i) 的合成

步骤一: 在反应瓶中加入6 g(0.02 mol) N-甲基-4-碘- 3-硝基苯甲酰胺 (5i)、60 mL四氢呋喃和4.2 mL三乙胺,搅拌溶解,加入0.44 g (0.63 mmol) 双 (三苯基磷) 二氯化钯、0.24 g (1.26 mmol) 碘化亚铜和6 mL (0.042 mol) 三甲基硅乙炔,室温反应1 h,减压浓缩蒸去大部分四氢呋喃,加入200 mL乙酸乙酯萃取,水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至干,柱色谱分离得固体产物3.8 g (0.014 mol),收率70.2%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6): δ 0.26 (s,9H),2.81 (d,3H,J = 4.5 Hz),7.87 (d,1H,J = 8.1 Hz),8.14 (dd,1H,J = 8.1,1.6 Hz),8.52 (d,1H,J = 1.5 Hz),8.83 (d,1H,J = 4.4 Hz); MS (m/z): 277 [M+H]+

步骤二: 在反应瓶中加入步骤一所得产物3.3 g(0.012 mol) 和20 mL甲醇,搅拌溶解,加入0.53 g (5.6 mmol) 二水合氟化钾,反应30 min,反应完毕,滴加60 mL水,过滤,烘干,得粗品,以乙酸乙酯/正己烷重结晶,得N-甲基-4-乙炔基-3-硝基苯甲酰胺 (4i)。

类似方法合成化合物4j4t,化合物波谱数据见表 2

1.8 N-甲基-4-氰基-3-硝基苯甲酰胺 (4u) 的合成

以化合物5i为原料,按1.3方法合成化合物4u

2 生物活性评价 2.1 细胞培养

取实验用细胞系 (人结肠癌HCT-116细胞、人乳腺癌MDA-MB435细胞、人白血病HL-60细胞),用含10% 小牛血清 (FBS)、2 mmol·L-1 L-谷氨酰胺的RPMI-1640或DMEM培养基,在37 ℃、5% 二氧化碳、全湿 (100% 相对湿度) 的培养箱中培养。

2.2 SRB法测定GI50

测定时将对数生长期的细胞配成细胞悬液,按每孔5×103~8×103接种于96孔培养板上。 每孔分别加入50 µL不同浓度的化合物,实验设阴性对照组 (不加药) 和阳性对照组 (iniparib),加入50 µL RPMI-1640或DMEM培养基。将96孔板置于37 ℃、5% 二氧化碳、全湿 (100% 相对湿度) 条件下培养48 h后,用三氯乙酸固定,每孔加入0.4% SRB液 ( 用1% 醋酸配制) 100 µL,室温放置20~30 min,用1% 醋酸洗涤,洗去未结合的SRB,空气中干燥。每孔加入200 µL Tris-base溶液使SRB溶解。在多功能酶标仪上(M5 detection system,MD Group Ltd.) 测定各孔OD值 (检测波长: 515 nm),使用XL- fit绘制剂量-反应曲线,然后用作图法计算出各自的GI50值。

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