药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1162-1168   PDF    
芒柄花苷与人体肠道细菌的相互作用研究
张蔚, 江曙, 钱大玮 , 尚尔鑫, 管汉亮, 任浩, 朱振华, 段金廒     
南京中医药大学, 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心, 江苏 南京 210023
摘要:研究人体肠道细菌对芒柄花苷的代谢和芒柄花苷对人体肠道细菌生长的影响。芒柄花苷与人体多种肠道细菌共孵育,采用UPLC-Q-TOF/MS技术与MetabolynxTM软件分析芒柄花苷经人体肠道细菌作用后的代谢产物;采用选择性培养基分别培养4类细菌(肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌),并采用光比浊法测定加入不同浓度芒柄花苷溶液后这4类细菌的生长变化,从而推测芒柄花苷对人体肠道菌群生长的影响。从药物-细菌孵育液中鉴定出芒柄花苷的去甲基化产物、羟基化产物、氢化产物及去糖基化产物等7种代谢产物;芒柄花苷加入后会抑制病原菌肠球菌和肠杆菌的生长,促进有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌的生长。结果提示,肠道细菌对芒柄花苷有代谢作用且由不同细菌完成,同时芒柄花苷对不同种类肠道细菌的生长有影响。
关键词芒柄花苷     肠道细菌     代谢产物    
The interaction between ononin and human intestinal bacteria
ZHANG Wei, JIANG Shu, QIAN Da-wei , SHANG Er-xin, GUAN Han-liang, REN Hao, ZHU Zhen-hua, DUAN Jin-ao     
Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract: The study aims to screen the ability of the bacteria to metabolize ononin and assess the effect of ononin on the intestinal bacteria. Fresh human fecal sample was obtained from a healthy volunteer, diluted serially in sterile water and sixty-nine different bacterial colonies were picked out ultimately. UPLC-Q-TOF/MS with automated data analysis software (MetaboLynxTM) was applied to fast analysis of ononin metabolites. Furthermore, an Emax precision microplate reader was employed to determine the growth situation of Enterococcous sp., Enterobacter sp., Lactobacilli sp., and Bifidobacteria sp. Results indicated that hydrogenation, demethylation, hydroxylation and deglycosylation were the major metabolic pathways of ononin by human intestinal bacteria in vitro. Ononin can inhibit the growth of pathogen such as Enterococcus sp., Enterobacter sp. and can promote the growth of probiotics such as Bifidobacteria sp. and Lactobacilli sp. This study suggested that intestinal bacteria have the metabolic effects of ononin and the biotransformation was completed by different bacteria. And ononin can affect the balance of intestinal flora and the degree of influence varies depending on the bacterial species and the concentration of ononin.
Key words: ononin     intestinal bacteria     metabolite    

人体肠道菌群对药物的代谢作用与药物对肠道菌群生长的影响,互为因果。正常情况下,不同菌种间相互依存、相互制约,在质和量上形成一种动态生物平衡,构成了肠道的生物屏障,是人体保持健康状态的一个重要环节。倘若疾病或药物滥用等情况会导致敏感肠道菌的生长被抑制,而未被抑制的肠道菌就会趁机大量快速繁殖,从而引起肠道菌群失调,而肠道的菌群失调又可加重病情或诱发多种疾病[1]。因此安全性高的口服药物不仅对机体本身无严重不良反应,而且对肠道微生物群的平衡也不应有严重影响。目前关于肠道细菌对药物的代谢研究较多[2,3,4],药物对肠道细菌生长影响的研究却鲜见报道。换言之,偏重于药物经肠道细菌代谢后代谢产物的寻找及其活性的研究,忽略了药物及其代谢产物对肠道细菌生长以及可能对机体健康状况产生的影响研究。

芒柄花苷是中药黄芪、甘草、红芪、葛根等药材中黄酮类化合物的代表性成分[5,6,7],具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中NO浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性[8]。目前,已有大量关于灌胃补阳还五汤或当归补血汤后大鼠血浆中芒柄花苷的药代动力学研究的报道[9,10,11],但有关人体肠道细菌对芒柄花苷的代谢和芒柄花苷对人体肠道细菌生长的影响研究都未见报道。本文采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-Q-TOF/MS) 与MetabolynxTM [12]软件寻找芒柄花苷与人体肠道混合菌及分离的单菌培养后的代谢产物; 采用选择性培养基分别培养得到人体代表性的4类细菌 (肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌[13]),并采用光比浊法测定加入不同浓度芒柄花苷溶液后这4类细菌的生长变化[14],从而推测芒柄花苷对人体肠道菌群平衡的影响,为揭示服用含有芒柄花苷成分的中药体内作用机制提供科学依据,也可为相似研究提供借鉴。

材料与方法

仪器与试药 UPLC AcquityTM系统 (Waters公司); SynaptTM Q-TOF质谱仪 (Waters公司),配有电喷雾离子源 (ESI); Masslynx 4.1质谱工作站软件 (Waters公司); MetaboLynxTM分析软件 (Waters公司); PerkbnElmer酶标仪 (Enspire公司)。伊红美兰琼脂培养基 (编号: HB0107)、肠球菌琼脂培养基 (编号: HB0133)、双歧杆菌BS培养基 (编号: HB0394)、乳酸杆菌LBS培养基 (编号: HB0385) 均购自青岛高科园海博生物技术有限公司; 芒柄花苷 (纯度>98%) 购自上海融禾医药科技有限公司 (批号: 130531); 乙腈 (Tedia) 色谱纯; 甲酸 (Merck) 色谱纯; 其余试剂为分析纯。

普通厌氧培养液 (GAM) 的配制及灭菌 精密称取胰蛋白胨10.00 g、大豆蛋白胨3.00 g、朊胨10.00 g、酵母浸膏5.00 g、血清消化粉13.50 g、牛肝浸出粉1.20 g、牛肉膏2.20 g、葡萄糖3.00 g、KH2PO4 2.50 g、NaCl 3.00 g、可溶性淀粉5.00 g、L-半胱氨酸盐0.30 g和硫代乙醇酸钠0.30 g,用超纯水加热溶解,调节至pH 7.2并最终定容至1 L。精密称取NaCl 2.70 g用 超纯水定容至300 mL。将厌氧培养液及生理盐水在121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,冷却后用于人体肠道细菌的分离。

选择性培养基的配制及灭菌 精密称取伊红美兰琼脂干粉37.40 g和肠球菌琼脂干粉56.25 g,分别加热溶解于1 L蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min,冷却至适宜温度,分别用于肠杆菌和肠球菌的分离; 精密称取双歧杆菌BS培养基68.90 g,再吸取1.0 mL的吐温-80,加热溶解于1 L蒸馏水中,116 ℃高压灭菌30 min,冷却至适宜温度后用于双歧杆菌的分离; 精密称取乳酸杆菌LBS培养基84.00 g,再吸取1.0 mL的吐温-80,加热溶解于1 L蒸馏水中,118 ℃高压灭菌15 min,冷却至适宜温度后再加入冰醋酸1.3 mL,充分混合,用于乳酸杆菌的分离。

对照品溶液的配制 精密称取芒柄花苷对照品适量,用超纯水超声溶解,配制成5.0 mg·mL-1的对照品溶液,于4 ℃保存备用。

人体肠道菌液的制备及细菌的分离、培养 收集健康女性志愿者 (受试者无肠道疾病或代谢性疾病史,且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素) 的新鲜粪便5.0 g,与生理盐水按比例1∶4 (g∶mL) 混合,涡旋2 min制成混悬液,再1 000 r·min-1离心10 min得上清液,即为肠道菌液。

将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释,吸取适当浓度的稀释液0.1 mL分别接种在GAM琼脂平板上,均匀涂布,并在37 ℃厌氧下培养。经过传代驯化和反复平板涂布,最终分离出69种细菌,分别标号为sp.1~sp.69。另外,通过选择性培养基分别分离出肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌。将以上分离得到的各种细菌保存于4 ℃待用。

含药肠道菌液的厌氧共培养及细菌供试液的制备 将混合菌及各单菌分别接种在含有1.0 mL厌氧培养液的离心管中,37 ℃条件下厌氧培养24 h,即得到细菌种子液。取出涡旋1 min,用生理盐水连续10倍稀释两次,从最终稀释液中吸取0.1 mL加到0.9 mL厌氧培养液中 (每份培养液均含8.6 μL芒柄花苷对照品溶液)。每种细菌平行做3份,并在37 ℃厌氧条件下培养48 h。同时做空白对照实验。48 h后取出含药肠道菌液,将每种细菌的3份平行培养液合并,以1~1.5倍的乙酸乙酯反复萃取3次,且合并各自萃取后的上清液。上清液在50 ℃烘箱中烘干,再用0.3 mL甲醇超声复溶,13 000 r·min-1离心10 min后吸取上清液,作为细菌样品的供试液。

色谱-质谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm,1.7 μm); 流动相: 乙腈 (A) 和0.1% 甲酸 (B),梯度洗脱 (0~7.5 min,10%~40% A; 7.5~9 min,40%~90% A; 9~10 min,90% A; 10~12 min,10% A),柱温35 ℃,流速0.4 mL·min-1,进样量 5 μL。

ESI源,扫描方式: ESI- 模式; 毛细管电压: 2 kV; 锥孔电压: 40 V; 离子源温度: 120 ℃; 脱溶剂气温度: 350 ℃; 锥孔气流量: 50 L·h-1; 脱溶剂气流量: 600 L·h-1; 碰撞能量 (6~40 V); 质量扫描范围: m/z 100~1 000; 准确质量测定采用芦丁溶液为锁定质量溶液; 数据采集模式: 碰撞能量梯度 (MSE); 数据分析: 质量亏损过滤 (MDF)。

代谢产物的鉴定与分析 将芒柄花苷可能的Ⅰ相代谢途径如: 还原、氧化、羟化、羟化甲基化等; 可能的Ⅱ相代谢途径如: 甲基化、乙酰化、磺酸化、羟化再磺酸化、葡糖醛酸化、羟化再葡糖醛酸化、磺酸化葡糖醛酸化、双葡糖醛酸化等输入MetabolynxTM 软件Metabolite List窗口中,质谱数据检测误差范围<10 mDa。

菌种活化 无菌条件下,将斜面保藏的菌种接种在普通厌氧培养液中,并在37 ℃培养箱中培养 24 h。取活化后的新鲜菌液离心弃去普通厌氧培养液,用生理盐水依次做10倍梯度稀释。取浓度为1×108 CFU·mL-1的菌悬液备用[15]

芒柄花苷紫外可见区吸收曲线扫描 精密称取芒柄花苷对照品1.50 mg溶解于体积分数50% 的乙醇溶剂中,配制成合适浓度的芒柄花苷溶液,以空白溶液作为参比,用分光光度计在波长200~900 nm间进行扫描。

菌悬液的准备及光学密度 (OD) 值的测定 取相同生长期的4种受试菌各100 μL,浓度为1×108 CFU·mL-1,分别加到1 mL含不同浓度芒柄花苷 (10、50和100 μg·mL-1) 的普通厌氧培养液中。从上述芒柄花苷-普通厌氧培养菌悬液中各取250 μL于96孔板上,同样体积不含芒柄花苷的菌悬液作空白对照,以仅含液态培养基的孔为参比,用酶标仪在600 nm波长,37 ℃条件下测定其OD值。测定 后将96孔板用保鲜膜包好加盖大小合适的铝箔,以保持水分并防止外界污染。包好的96孔板置于37 ℃培养箱中培养,每隔2 h测定并记录菌悬液的OD值,直至细菌生长达到稳定期[16]

数据处理与分析 所有实验均平行3份进行,数据处理采用GraphPad Prism 5.0软件。实验结果采用± s表示,P < 0.05表示有显著性差异,P < 0.01表示有极显著性差异。

结果 1 芒柄花苷代谢物的鉴定

MetabolynxTM软件以质量丢失滤过 (MDF) 处理为基础,根据采集的数据及设置的处理方法进行自动分析。经该软件处理后,检测到的经人体肠道细菌作用后的芒柄花苷的代谢产物共7个,见表 1。此外,发现混合菌以及单菌sp.23、sp.41-1、sp.45、sp.46、sp.52和sp.75能将芒柄花苷进行特定的代谢转化,分别检测到M1和M8 (混合菌)、M4 (sp.23)、M3 (sp.41-1)、M6 (sp.45)、M7 (sp.46)、M2 (s p.52)、M5 (sp.75)。

Table 1 Retention time and fragment ions of ononin and its metabolites by UPLC/ESI-MS
1.1 原形化合物M1

在混合菌样品中存在准分子离子峰 [M-H]- (m/z 429) 的化合物M1 (tR = 4.94 min),在二级质谱中有m/z 267 [M-Glu]-m/z 159、m/z 135等主要碎片离子峰,与芒柄花苷对照品相同,由此确定为芒柄花苷。

1.2 去甲基化产物M2

在52号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M2 (tR = 2.50 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为415,比芒柄花苷的准分子离子[M-H]- (m/z 429) 少14 u,说明M2可能为芒柄花苷结构中脱去了一分子甲基 (-14 u) 而形成的代谢产物。对M2进行二级质谱分析,主要有M2的准分子离子经脱糖后产生的m/z 253碎片离子,m/z 13 5和m/z 159的碎片离子分别是由m/z 253的碎片离子经RDA裂解和丢失B-环后所生成。故推测M2为芒柄花苷经52号细菌作用后的去甲基化产物。

1.3 羟基化产物M3

在41-1号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M3 (tR = 3.06 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为445,比芒柄花苷的准分子离子[M-H]- (m/z 429) 多16 u,说明M3可能为芒柄花苷结构中加上了一分子羟基 (+16 u) 而形成的代谢产物。对M3进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 429,283,267,147,135。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 445脱羟基后产生m/z 429的碎片离子,m/z 429离子脱去糖基后产生m/z 267的碎片离子,m/z 267离子通过RDA裂解反应进一步产生m/z 135的碎片离子; 准分子离子m/z 445脱去糖基后产生m/z 283的碎片离子,m/z 283的离子通过RDA裂解反应进一步产生m/z 147和m/z 135的碎片离子。由此分析M3应是芒柄花苷的羟基化产物,且羟基加在M3的B环上。

1.4 氢化产物M4

在23号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M4 (tR = 3.52 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为431,推测可能为芒柄花苷的氢化产物。对M4进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 429,269,159,133。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 431脱去糖基后产生m/z 269的碎片离子,m/z 135和m/z 159的碎片离子分别是由m/z 269的碎片离子经RDA裂解和丢失B-环后所生成。故推测M4为芒柄花苷经23号细菌作用后的氢化产物。

1.5 去甲基化的苷元M5

在75号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M5 (tR = 4.97 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为253,推测可能为去甲基化后的苷元。对M5进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 159,135,117。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 253通过RDA裂解反应产生了m/z 135和m/z 117的碎片离子,m/z 159碎片离子是由m/z 253的碎片离子经丢失B-环后所生成。故推测M5为芒柄花苷经75号细菌作用后形成的去甲基化的刺芒柄花素。

1.6 羟基化的苷元M6

在45号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M6 (tR = 5.25 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为283,推测可能为羟基化后的苷元。对M6进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 267,239,211,195,135。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 283脱羟基后产生了m/z 267的碎片离子,m/z 267的碎片离子分别脱去一分子羰基和两分子羰基形成了m/z 239和m/z 211的碎片离子,进一步脱羟基后形成了m/z 195的碎片离子。准分子离子m/z 283经RDA裂解反应产生了m/z 135的碎片离子。故推测M6为芒柄花苷经45号细菌作用后形成的羟基化的刺芒柄花素。

1.7 氢化的苷元M7

在46号样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M7 (tR = 6.32 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为269,推测可能为氢化后的苷元。对M7进行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 241,161,135,133。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 269脱羰基后产生了m/z 241的碎片离子,经RDA裂解反应产生了m/z 135和m/z 133的碎片离子,且脱去B环后产生了m/z 161的碎片离子。故推测M7为芒柄花苷经46号细菌作用后形成的氢化刺芒柄花素,且加氢反应发生在C环的2、3位上。

1.8 苷元M8

在混合菌样品的一级全扫描质谱中,代谢产物M8 (tR = 7.63 min) 的准分子离子峰 ([M-H]-) m/z为267,推测可能为苷元刺芒柄花素。对M8进 行二级质谱分析,其主要碎片离子峰有m/z 251,223,159,135和131。根据裂解规律可以推断出: 准分子离子m/z 267脱羟基后产生了m/z 251的碎片离子,再 经脱羰基后形成了m/z 223的碎片离子。经RDA裂解反应产生了m/z 135和m/z131的碎片离子,且脱去B环后产生了m/z 159的碎片离子。故推测M8为芒柄花苷经混合菌作用后形成苷元刺芒柄花素。

上述各代谢物的二级质谱以及其可能的裂解途径见图 1。芒柄花苷经肠道细菌作用后可能的代谢途径见图 2。综上,通过体外粪便温孵法及超高效液相四级杆飞行时间串联质谱手段检测到了芒柄花苷经人体肠道细菌作用后的7个代谢产物。结果表明,芒柄花苷在不同种的细菌作用下会发生不同类型的代谢转化。

Figure 1 UPLC-MS/MS spectra and proposed mechanism for the decomposition of the (A) M1 (m/z 429),(B) M2 (m/z 415),(C) M3 (m/z 445),(D) M4 (m/z 431),(E) M5 (m/z 253),(F) M6 (m/z 283),(G) M7 (m/z 269),and (H) M8 (m/z 267) [M-H]- ion of ononin

Figure 2 Possible metabolic pathway of ononin by intestinal bacterial
2 芒柄花苷对肠道细菌生长的影响测定

对于菌悬液,理论上测定波长λ可以取任意波长,但要注意避开芒柄花苷的强吸收区域。因芒柄花苷的可见区无明显吸收,在480~620 nm之间吸收曲线相对平滑,故选择600 nm作为检测波长。

采用酶标仪测定加入不同浓度芒柄花苷后上述4类细菌的生长情况,具体见图 3。结果表明,芒柄 花苷对病原菌肠球菌和肠杆菌有生长抑制作用,而且抑制作用通常会随着芒柄花苷浓度的升高而增强,在芒柄花苷浓度为10 μg·mL-1时抑制程度较弱,当浓度为100 μg·mL-1时抑制程度达到最大; 芒柄花苷对有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌有生长促进的作用,且此作用会随着芒柄花苷浓度的升高而减弱,在芒柄花苷浓度是10 μg·mL-1时促进程度最强,但当浓度达到100 μg·mL-1时会呈现一定程度的生长抑制作

Figure 3 Growth response of four strains of Enterococcous sp.,Enterobacter sp.,Bifidobacteria sp. and Lactobacilli sp. to the presence of ononin in GAM medium. n = 3,± s. P < 0.05,**P < 0.01 compared with the strains inoculated in GAM medium without the presence of ononin

用,提示芒柄花苷会影响肠道菌群的平衡且影响程度与细菌的种类及药物的浓度有关。

讨论

中药中多数苷类成分在口服后因亲脂性低而吸收较差不易转运到靶部位以至影响其发挥作用。文献报道苷由肠道细菌作用后的代谢产物通常极性减小,脂溶性增加,小肠吸收入血的速度由此加快而能较快达到所需血药浓度,发挥其药效作用。由图 2可看出,芒柄花苷M1经人体肠道细菌作用后直接脱糖转化为苷元M8,且中间产物M2~M4最终分别转化为代谢物M5~M7。由保留时间可知代谢物M5~M8的极性均减小,故推测可能会有利于其在肠道内的吸收。大量研究表明苷元芒柄花素具有显著的药理活性,如芒柄花素具有雌激素样作用及对生殖系统具有一定的安全性[17],能够调节血脂代谢及改善动脉粥样硬化病变[18,19],还具有清除氧自由基、血管平滑肌细胞增殖等作用[20]。此外,芒柄花素还应用于非小细胞肺癌的治疗[21]

本实验通过不同的选择性培养基筛选出了人体肠道中致病的肠球菌、肠杆菌及有益的双歧杆菌、乳酸杆菌作为测试对象,这4类优势代表菌种间的平衡关系与人体健康有着密切联系。其中,双歧杆菌与乳酸杆菌是人肠道内最常见也是最重要的益生菌群,参与宿主的营养、代谢、免疫等过程,对维持宿主健康起着重要的作用[22]。已有报道称双歧杆菌和乳酸杆菌在肠道上形成生理屏障,代谢出大量乳酸和乙酸,抑制了致病菌的生长,发挥生物拮抗作用; 人体肠道中的腐生菌在分解食物、胆汁过程中产生酚类、吲哚、甲基吲哚、有机胺、氨、粪臭素和硫化氢等致癌代谢产物,而双歧杆菌和乳酸杆菌代谢产生的乳酸和乙酸能加速肠道蠕动和通便,促使这些致癌物质排出体外而解毒[23]

据文献[24]报道,酚酸类化合物能够被双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌作为营养基质并转化利用为自身细胞提供能量,同时酚酸类化合物也是肠球菌和肠杆菌等有害菌中丙烯酰胺-N-乙酰基转移酶的一种有效的非竞争性抑制剂[25]。因此,芒柄花苷可能基于以上两种机制而具有促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长和抑制肠球菌和肠杆菌生长的作用。

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