药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1175-1180   PDF    
芳樟醇对十八甲基炔诺酮经皮渗透对映体选择性的影响
荣毅1, 俞文英1, 郭霞1, 曾珊珊1, 沈正荣1, 曾苏2, 叶金翠1     
1. 浙江省医学科学院药物研究所, 浙江 杭州 310013;
2. 浙江大学药学院, 浙江 杭州 310006
摘要:本文以十八甲基炔诺酮(norgestrel,NG) 为手性模型药物,研究其经离体大鼠皮肤渗透的对映体选择性以及手性促透剂芳樟醇和皮肤类脂对NG经皮渗透对映体选择性的影响。采用Valia-Chien双室渗透池进行离体皮肤渗透实验,手性HPLC法检测渗透液样品,考察了NG经完整皮肤和去类脂皮肤渗透的对映体选择性及芳樟醇的影响。结果表明,当dl-NG或l-NG于无水乙醇-水(2:8,v/v) 饱和溶液中,未观察到dl-NG经皮渗透的对映体选择性,但dl-NG的皮肤渗透速率是l-NG的2倍,这主要归因于l-NG和dl-NG间溶解度的差异;当加入dl-芳樟醇后,dl-NG出现对映体选择性渗透,l-NG的稳态渗透速率高出d-NG 22 %,而采用去类脂的皮肤进行相同实验时对映体选择性现象消失;傅里叶变换红外光谱检测显示,经dl-芳樟醇处理的皮肤角质层类脂的亚甲基不对称伸缩振动在波数上与对照组相比发生了蓝移。结果提示,dl-芳樟醇引起dl-NG对映体选择性经皮渗透与其对皮肤类脂的作用有关。皮肤类脂50%以上由手性物质神经酰胺组成,推测手性促透剂芳樟醇、皮肤类脂手性物质神经酰胺和/或手性药物NG之间可能存在对映体选择性相互作用。
关键词十八甲基炔诺酮     芳樟醇     对映体选择性     经皮给药    
The potential effects of linalool on enantioselective skin permeation of norgestrel
RONG Yi1, YU Wen-ying1, GUO Xia1, ZENG Shan-shan1, SHEN Zheng-rong1, ZENG Su2, YE Jin-cui1     
1. Institute of Materia Medica, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China;
2. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310006, China
Abstract: The purpose of this study is to investigate the enantioselectivity of norgestrel (NG) transdermal permeation and the potential influence of linalool and lipids on the enantioselectivity. In vitro skin permeation studies of NG across the excised rat skins were performed with Valia-Chien diffusion cells, and the permeation samples were analyzed by enantioselective HPLC. The possible enantioselective permeation of NG across intact rat back skin and lipids extracted rat back skin and the influence of linalool were evaluated. The skin permeation rate of dl-NG was two times higher than that of l-NG when donor solutions (EtOH/H2O 2:8, v/v) containing l-NG or dl-NG. It may be mainly attributed to the solubility discrepancy between enantiomer and racemate. The enantioselective permeation of dl-NG across intact rat skin was observed when the donor solutions containing dl-linalool. The permeation flux of l-NG was 22% higher than that of d-NG. But interestingly, the enantioselective permeation of dl-NG disappeared under the same experimental condition except that the lipid extracted rat skin was used. Attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy analysis of stratum corneum showed that the wave number for asymmetric CH2 stretching vibrations of lipids treated with dl-linalool was greater than that of the control. The results indicated that the enantioselective permeation of NG may be contributed by the interaction between dl-linalool and lipids. More than half of lipids were composed of ceramides. The stereospecific interaction maybe existed among chiral enhancer (linalool), lipids (ceramides) and/or chiral drugs (NG).
Key words: norgestrel     linalool     enantioselectivity     transdermal administration    

经皮给药具有安全、长效和避免肝脏首过效应等优点,是新型给药系统的研究热点之一,其中不可避免地会涉及手性药物。手性药物经皮渗透可能产生对映体选择性,即一个对映体的皮肤渗透速率显著地大于另一个对映体。影响经皮渗透对映体选择性的因素主要有以下两点: 首先,药物经皮转运的屏障角质层主要由手性物质角蛋白和神经酰胺组成 (角质层细胞间类脂中神经酰胺所占比例 > 50%)[1],皮肤手性组成与手性药物潜在的对映体选择性结合被认为是产生对映体选择性的内因; 其次,制剂处方中的手性辅料 (如手性促透剂等) 与手性药物或皮肤手性物质间也可能产生对映体选择性相互作用[2],进而引起对映体选择性渗透。

如果以外消旋体给药时产生对映体选择性渗透[3],特别是当无效、低效或产生副作用的对映体渗透速率更大时,则可能显著地影响药物的药效和毒性。另外,即使以单对映体给药也可能在经皮转运的过程中因酶的对映体选择性作用而存在对映体转化的风险[4]。因此,有必要对手性药物经皮转运的对映体选择性及其影响因素进行研究,为安全、有效的经皮给药系统的研发提供理论指导与技术支持。目前,国内外在该方面的研究很少,已发表的文献[5]报道主要集中在是否存在对映体选择性渗透现象本身,而对于产生的原因、机制及可能的影响因素等方面的报道更少。

十八甲基炔诺酮 (norgestrel,NG ,图 1A) 是孕激素类手性药物,其药理活性来自左旋体,右旋体无 效[6]。临床上常与雌激素联合用于女性避孕和治疗更年期综合征。NG通过经皮给药[7]可避免肝脏首过效应,并以恒定速率释放有效剂量的药物以降低副作用。萜烯类促透剂是从天然植物中提取,具有低毒、高效的特点,一般多具手性中心[8],其与手性药物及皮肤手性物质可能存在对映体选择性相互作用。衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法 (attenuated total reflection- fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR) 被认为是测定角质层中分子振动最有效的工具,已有研究将角质层每个振动峰的来源进行了归属[9],根据红外吸收峰波数的改变可大体反映其组成或构象的变化,因而可通过ATR-FTIR研究角质层结构细微的变化来探索产生对映体选择性渗透的潜在作用机制。本文选取NG为模型药物,采用Valia-Chien双室渗透池进行皮肤渗透实验,研究NG经离体大鼠皮肤渗透的对映体选择性,以及萜烯类手性促透剂芳樟醇 (linalool,图 1B) 的影响。同时采用去类脂皮肤进行皮肤渗透实验,ATR-FTIR检测经不同供给液处理的皮肤角质层,探究类脂在NG经皮渗透对映体选择性中的作用。

Figure 1 The structural formulae of norgestrel (A) and linalool (B)

材料与方法

仪器 Agilent 1260 Infinity HPLC系统 (美国Agilent公司),含G1311B四元泵、G1329B自动进 样器、G1316A柱温箱和G1314F VWD紫外检测器; Valia-Chien透皮扩散仪 (S = 0.65 cm2,V = 4 mL,浙 江大学玻璃仪器厂); Bruker Vector 22 FT-IR光谱仪 (德国Bruker公司)。

药品与试剂 dl-NG和l-NG (江苏扬州制药厂); 芳樟醇 (美国Sigma-Aldrich公司); PEG-400 (上海 浦东高南化工厂); NaH2PO4 (上海绿源精细化工厂); HP-β-CD (取代度4~9,西安德立生化有限公司); 0.25% 胰蛋白酶 (杭州吉诺生物技术有限公司); 甲醇和乙腈 (德国Merck公司,色谱纯); 氯仿 (汕头市西陇化工厂有限公司); 水为纯化水; 其余所使用分析试剂均为分析纯。

实验大鼠及其皮肤的处理 健康雌性SD大鼠,体重 (300 ± 10) g,浙江省实验动物中心提供,动物合格证编号: SYXK (浙) 2011-0166。大鼠颈部脱臼法处死,用电动剃刀剃去背部皮肤毛发,除去皮下脂肪层后用生理盐水洗净,滤纸吸干,用铝箔包封,于 -20 ℃冻存备用。

皮肤角质层分离及处理 将预处理过的大鼠背部皮肤在含0.25% 胰蛋白酶的溶液中37 ℃消化24 h[10],用棉签分离出角质层,超纯水洗净后浸泡于皮肤渗透供给液,即含0.3 mol·L-1萜烯类手性促透剂 (dl-、l-芳樟醇) 和不含芳樟醇的无水乙醇-水 (2∶8,v/v),在32 ℃恒温水浴中以500 r·min-1匀速搅拌6 h。随后用超纯水洗净,滤纸吸干,置于干燥器中供ATR-FTIR检测。

皮肤角质层类脂提取 角质层类脂的提取方法参照Obata等[10]的研究,将经胰蛋白酶消化后分离出的角质层在氯仿-甲醇 (2∶1,v/v) 混合溶液中分别提取2和4 h,用氮气流挥干有机溶剂,然后将提取出来的类脂和剩余的角质层储存于干燥器中,供ATR-FTIR检测。另外,将经去皮下脂肪的完整离体大鼠皮肤置于氯仿-甲醇 (2∶1,v/v) 混合溶液中提取类脂4 h,然后用生理盐水洗净,滤纸吸干,铝箔包封,于 -20 ℃冻存用于经皮渗透实验。

溶解度实验 将过量的NG加入到水、无水乙 醇-水(2∶8,v/v) 以及含0.3 mol·L-1芳樟醇的无水乙醇-水 (2∶8,v/v) 等供给溶剂中,用Teflon膜封 口,在37 ℃恒温水浴振荡48 h,样品离心,取上清液以甲醇稀释至适当浓度,HPLC检测,以3个样品的溶解度计算平均值。

离体皮肤渗透实验 将经去皮下脂肪的离体大鼠皮肤从冰箱取出,恢复常温后于生理盐水中浸泡30 min,用滤纸吸干,置于Valia-Chien双室渗透池的两个半池之间,角质层面向供给室,用夹子固定,于供给室中加入相应的药物供给液4 mL,接收室中加入接收液 (含20% PEG-400生理盐水) 4 mL,磁力搅拌转速为500 r·min-1; 循环水浴温度为32 ℃。分别 于4、6、8、10、24、32和48 h,从接收池取样0.5 mL,并补充等量同温度的空白接收液。样品冷藏保存,测定前用0.45 µm的微孔滤膜过滤。

芳樟醇和类脂对NG对映体选择性经皮渗透的影响 NG在饱和状态下经皮渗透对映体选择性皮肤渗透预实验表明,以水为供给溶剂,药物的经皮渗透量过低达不到对映体分离的定量下限要求,故选择dl-NG和l-NG在无水乙醇-水(2∶8,v/v) 中的过饱和溶液作为供给液,其余步骤同“离体皮肤渗透实验”操作。

芳樟醇对NG经皮渗透对映体选择性的影响 向以无水乙醇-水 (2∶8,v/v) 为溶剂的dl-NG和l-NG过饱和溶液中分别加入0.3 mol·L-1 dl-芳樟醇或l-芳樟醇作为供给液,进行皮肤渗透实验。

类脂对NG经皮渗透对映体选择性的影响 采用去类脂处理的大鼠背部皮肤进行经皮渗透实验,其余操作与使用完整皮肤相同。

ATR-FTIR测定 IR光谱在4 000~600 cm-1波数下采集,分辨率为4 cm-1。将完整角质层、经芳樟醇处理的角质层样品、提取的类脂以及去类脂的角质层分别进行ATR-FTIR检测。

皮肤渗透液中的药物浓度检测根据作者前期建立的手性流动相添加剂HPLC方法检测皮肤渗透液中药物对映体浓度[11]。色谱柱: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱 (150 mm × 4.6 mm,5 µm); 流动相: NaH2PO4缓冲液 (pH 5.0,20 mmol·L-1)-乙腈 (70∶30,v/v),缓冲液中含25 mmol·L-1 HP-β-CD; 流速: 1 mL·min-1; 柱温: 20 ℃; 进样量: 20 µL; 检测波长: 240 nm。

数据处理与分析 接收液中药物的累积渗透量 (Q) 按公式 (1) 进行计算。

式中Ci为第i次取样时接收液中的药物浓度; V1为接收室体积; V2为每次取样体积。以Q对时间 (t) 作图,将直线部分进行线性回归,所得直线斜率为渗透速率 (J,µg·cm-2·h-1),直线延伸部分与时间轴相交,求得时滞。数据采用单因素方差分析,当P < 0.05时认为存在统计学显著性差异。

结果 1 l-NG和dl-NG的溶解度

l-NG和dl-NG于各种供给溶剂中的溶解度见表 1。NG在水中几乎不溶,水中加入20%无水乙醇NG溶解度增加约3倍,而在l-芳樟醇和dl-芳樟醇的无水乙醇-水 (2∶8,v/v) 溶液中,l-NG和dl-NG的溶解度相比在水溶液中分别增加了约4倍,但dl-NG/l-NG在各种供给溶液中的溶解度比值均在1.6~2.0之间。

Table 1 The solubilities of NG in different donor vehicles. Each value represents the mean ± SD (n = 3). Sol: Solubility
2 NG经离体大鼠皮肤渗透的对映体选择性 2.1 NG经离体大鼠皮肤渗透 当供给液为l-NG或

dl-NG的无水乙醇-水 (2∶8,v/v) 饱和溶液时,l-NG、dl-NG的稳态渗透速率如表 2所示,dl-NG的皮肤渗透速率是l-NG的2倍。而当供给室药物为dl-NG时,对映体间的渗透速率相当 [l-NG、d-NG的渗透速率分别为 (0.15 ± 0.03) 和 (0.14 ± 0.03) μg·cm-2·h-1],也未观察到经皮渗透时对映体转化。结果表明,dl-NG在饱和溶液状态下经离体大鼠皮肤渗透未出现对映体选择性,而l-NG和dl-NG间的皮肤渗透速率差异可能主要归因于两者溶解度的差异 (表 1)。

Table 2 Steady-state skin permeation rates of NG from donor solutions across excised rat skin. Control: EtOH/H2O (2∶8,v/v). Temperature: 32 ℃; Stirring speed: 500 r·min-1; Each value represents the mean ± SD (n = 8)
2.2 芳樟醇对NG

经皮渗透对映体选择性的影响当供给液为含0.3 mol·L-1 l-芳樟醇或dl-芳樟醇的无水乙醇-水 (2∶8,v/v) NG饱和液时,NG对映体累积渗透量-时间曲线见图 2,经皮稳态渗透速率见表 2。芳樟醇对NG有显著的促透作用,且使NG的渗透时滞显著缩短,皮肤渗透速率显著增加 (P < 0.05),但dl-NG/l-NG的稳态渗透速率比仍为1.8~1.9,与对照组相比未发生显著变化 (P > 0.05)。当供给液中含l-芳樟醇时,dl-NG经皮渗透时对映体间的渗透速率相当 (图 2B); 而当供给液中含dl-芳樟醇时,dl-NG出现对映体选择性经皮渗透,l-NG的稳态经皮渗透速率高出d-NG 22% (图 2A)。

Figure 2 Permeation profiles of NG enantiomers across excised rat skin from donor vehicles containing 0.3 mol·L-1 dl-linalool (A) or 0.3 mol·L-1 l-linalool (B)
2.3 角质层类脂对NG

经皮渗透对映体选择性的影响 当采用去类脂处理的大鼠背部皮肤进行经皮渗透实验时,NG对映体累积渗透量-时间曲线见图 3,经皮稳态渗透速率见表 2。结果表明,当供给液为无水乙醇-水 (2∶8,v/v) 的NG饱和溶液时,相比完整的大鼠皮肤,dl-NG和l-NG经去类脂皮肤的渗透速率提高了约3倍,验证了角质层中的类脂是构成药物经皮渗透屏障的重要组分。另外,供给液中加入0.3 mol·L-1 l-芳樟醇或dl-芳樟醇后,与不加促透剂的对照组比

Figure 3 Permeation profiles of NG enantiomers across ceramides extracted rat skin from donor vehicles. (A) EtOH/H2O (2∶8,v/v); (B) EtOH/H2O (2∶8,v/v) containing 0.3 mol·L-1 dl-linalool; (C) EtOH/H2O (2∶8,v/v) containing 0.3 mol·L-1 l-linalool

较,NG的皮肤渗透速率不再增加,提示芳樟醇的促透机制很大程度上归因于其对角质层中类脂的提取或干扰作用; 同时,与经完整皮肤的渗透结果相反,皮肤去类脂后,dl-芳樟醇对dl-NG对映体选择性经 皮渗透的现象消失,即dl-NG经皮渗透后l-NG和d-NG渗透速率无显著性差异 (图 3B,P > 0.05),结果提示,dl-芳樟醇对dl-NG的对映体选择性经皮促透作用与dl-芳樟醇对类脂的作用有关,dl-芳樟醇与类脂的主成分手性物质神经酰胺之间可能存在对映体选择性相互作用,从而引起dl-NG经皮渗透的对映 体选择性。

3 芳樟醇对角质层类脂的影响

在完整角质层中,亚甲基的不对称伸缩振动 (~2 920 cm-1) 和对称伸缩振动 (~2 850 cm-1) 被认为是细胞间类脂的特征吸收峰,而类脂主要由神经酰胺 (图 4) 组成,神经酰胺由鞘氨醇和脂肪酸碳链结合而成。角质层皮肤经促透剂处理后,角质层类脂红外光谱特征峰位移如表 3所示。经含dl-芳樟醇的供给液处理的皮肤角质层,其类脂的亚甲基不对称伸缩振动在波数上与对照组相比发生了蓝移; 而含l-芳樟醇的供给液处理的皮肤角质层与对照组相比则无改变。结果提示,dl-芳樟醇和l-芳樟醇对角质层类脂的作用有所不同。

Figure 4 Ceramide structures[12]. Four possible sphingosine related chains (A) are linked via an amide bond to either of three different fatty acid components (B) resulting in,theoretically,12 different ceramide subclasses

Table 3 The asymmetric and symmetric CH2 stretching frequencies of ceramides in the stratum corneum (SC) at 32 ℃. Control: EtOH/H2O (2∶8,v/v). Each value represents the mean ± SD (n = 3)

比较完整的大鼠皮肤角质层、有机溶剂提取2和4 h的角质层以及提取的类脂的ATR-FTIR图谱(图 5),结果显示,与完整角质层皮肤相比 (图 5A),经氯仿-甲醇 (2∶1,v/v) 2 h提取的角质层在2 920和2 850 cm-1处的红外吸收明显减少 (图 5B),而4 h后吸收基本消失 (图 5C); 提取液 (图 5D) 中显示类脂的特征吸收峰。结果证实,经有机溶剂提取4 h后,角质层中的类脂基本被提取完全。

Figure 5 The infrared spectrum of the rat stratum corneum. (A) Intact stratum corneum; (B) Stratum corneum incubated in chloroform/methanol mixtures (2∶1,v/v) for 2 h; (C) Stratum corneum incubated in chloroform/methanol mixtures (2∶1,v/v) for 4 h; (D) Extracted lipid
讨论

药物的熔点是其皮肤渗透性的重要影响因素之一,由于结晶结构的差异,手性药物单个对映体的熔点通常不同于消旋体,熔点不同,溶解度亦不同[13]。局部给药制剂药物的热力学活度是其经皮渗透的驱动力,药物呈饱和状态时热力学活度最大,皮肤渗透速率最大。故本研究考察药物在不同供给液中的溶解度,将其作为除皮肤手性环境外对映体选择性渗透的另一个影响因素。

l-NG和dl-NG的熔点分别为240 ℃和210 ℃,在本实验所采用的供给溶剂中dl-NG的溶解度是l-NG的1.6~2.0倍,而dl-NG的皮肤渗透速率也是l-NG的1.5~2.1倍。因此,l-NG和dl-NG间的皮肤渗透速率差异应主要归因于两者熔点不同所致溶解度差异。该现象亦可见于Kommuru等[14]对酮洛芬对映体选择性经皮渗透的研究,酮洛芬右旋体的熔点比其消旋体低20 ℃,当采用饱和溶液开展实验时,右旋酮洛芬的皮肤渗透速率远高于消旋体。

本研究中萜烯类手性促透剂芳樟醇的加入使NG的皮肤渗透速率得到显著提高,dl-芳樟醇引起dl-NG对映体选择性经皮渗透,l-NG的稳态经皮渗透速率高出d-NG 22%。通过比较NG经完整皮肤与去类 脂皮肤渗透的实验结果发现,皮肤角质层去类脂后,芳樟醇不再显现对NG的促透作用,且dl-芳樟醇致dl-NG对映体选择性经皮渗透的现象消失。该结果进一步证实芳樟醇的促透机制是提取和 打乱角质层类脂[15]导致的。同时,dl-芳樟醇对dl-NG的对映体选择性促透作用与皮肤角质层的类脂有关。另外,芳樟醇自身作为手性促进剂,其消旋体dl-芳樟醇和单对映体l-芳樟醇对同一药物的促透效果也可能不同,例如,dl-芳樟醇对dl-NG、l-NG的促透作用均显著地高于l-芳樟醇 (本文未包含该研究数据),但机制尚不清楚。

ATR-FTIR检测结果显示,经含dl-芳樟醇供给液浸泡过的角质层,其类脂的亚甲基不对称伸缩振动在波数上与对照组相比发生了蓝移,而经l-芳樟醇浸泡的样品在波数上与对照组无变化。结果提示,dl-芳樟醇和l-芳樟醇对类脂的作用有差异,这种差异可能主要归因于d-芳樟醇和l-芳樟醇间的空间结构不同,与同为手性的皮肤神经酰胺之间产生对映体选择性相互作用。皮肤角质层细胞间类脂的组成主要是神经酰胺,其结构中在含羟基基团处一般具有多个手性中心(图 4A),可与外来手性物质产生对映体选择性相互作用。Heard等[16]证实了神经酰胺与麻黄素存在对映体选择性结合。Obata等[10]利用红外光谱发现经l-薄荷醇处理的角质层,其细胞间类脂的亚甲基不对称和对称伸缩振动产生波数变化,表明l-薄荷醇与类脂存在相互作用。因此,推测dl-芳樟醇对dl-NG的对映体选择性促透作用可能与dl-芳樟醇、角质层类脂神经酰胺和/或手性药物间的对映体选择性相互作用有关。

本文报道了dl-芳樟醇对NG的对映体选择性促透作用,以及这种对映体选择性促透作用与角质层类脂 (神经酰胺) 的相关性。结果提示,制剂处方中的手性辅料如手性促透剂可引起手性药物经皮渗透的对映体选择性,当手性药物对映体间的药理作用存在差异时,研制手性药物经皮给药制剂中开展药物经皮渗透的对映体选择性评价是必要的。但对于手性药物、手性辅料与皮肤手性物质间的对映体选择性相互作用及影响因素需要进行更深入的研究。

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