药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1188-1193   PDF    
载阿霉素普朗尼克化聚酰胺-胺树状聚合物对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR的抑制作用
顾卓珺1 , 王萌2, 方琼艳1, 王成润2, 郑怀宇1    
1. 舟山医院, 浙江 舟山 316021;
2. 浙江大学药学院, 浙江 杭州 310058
摘要:本文合成了普朗尼克修饰的聚酰胺-胺聚合物(PF127-PAMAM),以阿霉素(DOX) 为模型药物,考察了该载药复合物对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR的抑制作用。核磁共振图谱及红外图谱表明聚合物成功合成,元素分析法测得每个聚酰胺-胺分子伯氨基的普朗尼克化程度为27.63%(PAMAM:PF127,1:35.37,摩尔比)。PF127-PAMAM较PAMAM水合粒径增大,zeta电位有所降低。较低的电位及PF127的保护作用使得PF127-PAMAM有较低的溶血性和细胞毒性。每个PF127-PAMAM分子可以负载19.58个DOX分子,载药复合物的释放具有缓慢释放及pH敏感的特性。对于乳腺癌细胞株MCF-7,PF127-PAMAM/DOX的细胞毒性较游离DOX稍弱;而对于乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR,PF127-PAMAM/DOX则表现出较强的逆转耐药性的效果,其耐药逆转指数(RRI) 高达33.15。
关键词聚酰胺-胺     普朗尼克     阿霉素     多药耐药    
Inhibition of MCF-7/ADR cells by DOX-loaded pluronic-attached PAMAM dendrimer conjugate
GU Zhuo-jun1 , WANG Meng2, FANG Qiong-yan1, WANG Cheng-run2, ZHENG Huai-yu1    
1. Zhoushan Hospital, Zhoushan 316021, China;
2. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract: Pluronic modified polyamidoamine (PAMAM) conjugate (PF127-PAMAM) was prepared and the inhibiting effect of MDR against MCF-7/ADR was investigated with doxorubicin (DOX) as model drug. 1H NMR and FTIR spectra showed that the conjugate was synthesized successfully. Element analysis accu-rately measured that 27.63% amino of per PAMAM was modified by pluronic (PAMAM:PF127, 1:35.37 mole ratio). PF127-PAMAM showed an increased size and a reduced zeta potential compared to PAMAM. PF127-PAMAM had lower hemolytic toxicity and cytotoxicity due to the reduced zeta potential and the protection of PF127. Each PF127-PAMAM molecular could load 19.58 DOX molecules, and the complex exhibited sustained and pH-sensitive release behavior. PF127-PAMAM/DOX exhibited weaker cytotoxicity than free DOX in MCF-7 cells; while the complex showed much stronger reverse effect of drug resistance in MCF-7/ADR cells, and resistance reversion index (RRI) was as high as 33.15.
Key words: polyamidoamine     pluronic     doxorubicin     multidrug resistance    

肿瘤的多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一[1, 2, 3]。药物传递系统已成为克服肿瘤多药耐药 (MDR) 的新策略。各种药物传递系统为克服肿瘤多药耐药提供了一个平台, 如聚合物胶束、纳米粒和脂质体等[4, 5, 6, 7, 8]

聚酰胺-胺 (PAMAM) 树状聚合物是一种高度分支的球形大分子, 其分子量、形状可控, 生物相容性好, 表面具有大量可修饰官能团而成为药物和基因的良好载体[9, 10, 11, 12, 13]。PAMAM聚合物主要通过两种方式实现对药物的负载。一种是通过表面的伯胺基团与药物进行共价结合; 另一种是通过物理作用负载药物分子。例如,Zhuo等[14]将5-氟尿嘧啶接枝到PAMAM聚合物的氨基上作为药物载体。Han等[15]利用PAMAM聚合物的疏水性内核实现对阿霉素的包载。

PAMAM表面的氨基在生理环境中易质子化而使其带有较高的正电荷, 因此具有较高的毒性。聚乙二醇 (PEG) 常用来修饰PAMAM以降低其毒性, 增加其生物相容性并实现长循环[16, 17]

普朗尼克 (pluronic) 是由聚氧乙烯 (EO) 和聚氧丙烯 (PO) 组成的非离子型三嵌段共聚物。因其 具有两亲性, 常用于聚合物胶束的制备, 并在克服肿瘤多药耐药方面取得了良好的效果[18, 19]。普朗尼克混合胶束, 如P123/F127等, 可用于多药耐药肿瘤的治疗[18, 20]。普朗尼克可以通过降低耐药细胞的ATP水平、抑制药物外排蛋白 (如P-gp)、增加对凋亡信号的敏感度、增加细胞质中活性氧(ROS) 的水平等来实现逆转多药耐药的作用[21]。有研究报道, 经普朗尼克F127修饰后,PAMAM聚合物的安全性大大提高[22]。普朗尼克F127具有良好的生物相容性, 已被美国食品药品监督管理局 (FDA) 所批准[20]

本文利用普朗尼克F127 (PF127) 修饰PAMAM, 目的在于降低PAMAM树状聚合物的毒性, 提高其生物利用度, 并能达到逆转乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR耐药性的效果。

材料与方法 试剂与材料

聚酰胺-胺 (PAMAM G5.0, MW28 826, 威海市晨源有机硅新材料有限公司); 普朗尼克F127 (MW 12 600, 上海BASF公司馈赠); 对硝基氯甲酸苯酯, 四甲基氮唑蓝 (MTT) (美国Sigma公司); 盐酸阿霉素 (DOX,北京华奉联博科技有限公司); 胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司); 1640培养液, 胰蛋白酶 (吉诺生物医药技术有限公司); 其他试剂均为分析纯。

仪器

TU-1800PC型紫外-可见分光光度仪 (北京普析通用仪器有限公司); AVIII500M型核磁共振仪 (瑞士Bruker公司); ANTARIS型红外光谱仪和MK3型酶标仪 (美国Thermo公司); EA 1112型元素分析仪 (意大利CE仪器公司); NANO ZS90型纳米粒度分析仪 (英国Malvern公司); 纯水仪 (美国Millipore公司)。

PF127的活化

PF127的活化及普朗尼克化的PAMAM接枝物的合成均参考PEG修饰的PAMAM聚合物的合成 (合成路线1)[23]。取对硝基氯甲酸苯酯0.2 mmol溶于适量的苯中, 于搅拌条件下, 将对硝 基氯甲酸苯酯的苯溶液逐滴加入到等摩尔量的PF127苯溶液中, 滴加完毕后, 通入氮气, 室温下搅拌反应24 h。反应结束后, 将反应混合液用10倍体积的石油醚沉淀3次,4 000×g离心10 min。取白色沉淀于室温下真空干燥过夜, 除去残留的有机溶剂, 获得对硝基氯甲酸苯酯活化的普朗尼克 (APF127)。活化率按照公式(1) 进行计算:

其中S-C6H4- 是芳基质子峰面积; 4表示芳基质子的数目; S-CH3是甲基质子峰面积; 3表示甲基质子的数目。

普朗尼克化的PAMAM接枝物的合成

取 0.52 μmol PAMAM G5溶于适量的DMSO中, 搅拌条件下加入20 μmol APF127, 室温条件下搅拌反应 4天, 将反应溶液装入透析袋 (MWCO 14 000) 中, 于纯水中进行透析, 每4小时换水, 透析3天。最后将截留液冻干得到普朗尼克F127修饰的PAMAM 接枝物 (PF127-PAMAM)。

Scheme 1 Synthesis of pluronic-attached PAMAM dendrimer conjugates
APF127和PF127-PAMAM的表征

产物APF127和PF127-PAMAM采用1H NMR (D2O为溶剂)、FTIR (KBr压片) 进行表征。采用元素分析法测定PF127- PAMAM中的碳、氮含量, 从而得到准确的接枝率。采用纳米粒度仪测定PAMAM和PF127-PAMAM的粒径及电位。

PF127-PAMAM/DOX复合物的制备

将盐酸阿霉素3.2 mg (5.5 μmol) 溶于1.6 mL甲醇和丙酮混合液 (体积比1∶1) 中, 加入5 μL三乙胺使之脱盐, 制成阿霉素溶液。取20 nmol PF127-PAMAM溶于 2 mL PBS (pH 7.4) 中, 加入上述阿霉素溶液120 μL (412 nmol), 室温下避光搅拌24 h。13 000×g离心 10 min, 除去未负载的阿霉素。取上清液适量用PBS (pH 7.4) 稀释后, 采用UV-Vis分光光度计测定稀释液在479 nm处的吸光度, 按照阿霉素标准曲线计算稀释液中阿霉素的含量。上清液冻干即得载药复合物。

PF127-PAMAM/DOX复合物的体外释放研究

载药复合物分别溶于pH为5.5、7.4的PBS缓冲液 中, 配成阿霉素质量浓度为40 μg·mL-1溶液。分别取2 mL溶液于透析袋 (MWCO 14 000) 中, 然后将透析袋置于20 mL PBS缓冲液 (pH 7.4) 释放介质中,37 ℃、100 r·min-1恒温振荡条件下进行释放。于0.5、1、2、4、6、8、12、24和48 h取样, 从透析介质中每次取出2 mL, 并立即补加2 mL新鲜的缓冲液介质。采用UV-Vis分光光度计测定每个时间点的释放介质在479 nm处的吸光度, 进一步测定累计释放量。

红细胞溶血实验

取血于肝素化试管中,3 000 r·min-1离心10 min, 得红细胞。同法用PBS洗3次, 最后用PBS重悬细胞, 配成1.5% (体积比) 的红细胞PBS液,4 ℃保存。一定浓度的PAMAM或PF127- PAMAM的PBS液加入等体积的血细胞,37 ℃孵育 4 h后,13000 r·min-1离心10 min, 采用UV-Vis分光光度法测定上清液在540 nm处的吸光度 (A)。以PBS为阴性对照,0.2% Triton X-100为阳性对照。

细胞存活率实验

取对数生长期的MCF-7或MCF-7/ADR肿瘤细胞, 用胰酶消化后, 加入细胞培养液吹打分散均匀并制备成细胞悬液 (约50 000个/ mL)。取细胞悬液100 μL加入96孔板中。培养板于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育贴壁。分别将PAMAM及PF127-PAMAM、DOX及PF127-PAMAM/ DOX (以DOX含量计) 溶于PBS 7.4中, 稀释成相同的浓度梯度, 然后加入96孔板中,25 μL/孔, 每组设 3个复孔。阳性对照组加入PBS。37 ℃、5% CO2条件下孵育48 h后, 每孔加入MTT溶液 (5 mg·mL-1) 31.5 μL, 于培养箱内37 ℃、5% CO2继续培养4 h, 吸去孔内溶液, 每孔加入二甲基亚砜200 μL。用酶标仪振荡5 min, 于570 nm处测定各孔A值, 计算细胞生长抑制率。

结果与讨论 1 核磁图谱表征

产物APF127和PF127-PAMAM的核磁图谱见图 1。图中1.19为PF127的 -CH3特征峰。PF127经对硝基氯甲酸苯酯活化后, 在6.9~8.4之间的新峰为苯环上的H, 表明PF127活化成功。PF127的活化率约为81.35%。

Figure 1 1H NMR spectra of PF127 (a),APF127 (b),PAMAM (c) and PF127-PAMAM (d)

PAMAM的质子峰归属如下: 2.46 (NCH2CH2CO),2.63 (CONHCH2CH2N),2.76 (CONHCH2CH2N),2.83 (NCH2CH2CO),3.27和3.37 (CONHCH2CH2NH2,NCH2CH2NHCO)。PF127-PAMAM的1H NMR图中除了有PF127的特征质子峰, 也有PAMAM的特征质子峰。表明PF127成功接枝到了PAMAM上。

2 红外图谱表征

产物APF127、PF127-PAMAM的红外图谱见图 2。APF127在1 770 cm-1处的峰, 归属为C=O (酯键) 的伸缩振动峰, 说明PF127活化成功。PF127-PAMAM在1 649 cm-1处的峰, 为PAMAM酰胺键C=O的伸缩振动峰; 1 555 cm-1处的峰为C-N的伸缩振动峰 及NH的弯曲振动峰, 这表明PF127成功接枝到了PAMAM上。

Figure 2 FTIR spectra of PF127,APF127 and PF127-PAMAM
3 元素分析表征

采用元素分析法测定PF127-PAMAM中的碳、氮含量, 得到PAMAM分子普朗尼克化程度[24]。测得产物的含碳量为55.84%、含氮量为1.48%, 利用碳、氮含量计算得到1个PAMAM分子接枝的普朗尼克F127数目为35.37个,PAMAM分子伯氨基普朗尼克化的实际程度为27.63%。而1个PAMAM分子接枝的普朗尼克F127的理论数目为38.40个, 理论普朗 尼克化程度为30%。这说明所有APF127并未完全接枝于PAMAM上。可能是已接枝上的PF127的空间位阻效应阻碍了继续反应。

4 粒径和电位表征

测得PAMAM及PF127-PAMAM的粒径及 zeta电位结果见表 1。所测得PAMAM水合粒径值 (165.2 ± 16.8 nm) 远大于理论值 (< 10 nm), 这主要是因为PAMAM在水溶液中发生聚集[15]。经PF127修饰后,PF127-PAMAM 的水合粒径值 (268.3 ± 21.7 nm) 较PAMAM的粒径值增大, 而较大的粒径值可能与聚合物的聚集有关。若应用于体内肿瘤治疗, 聚合物经过血液稀释后, 可能发生解聚, 粒径随之减小。经普朗尼克化后, 电位值降低。因为修饰后, 表面的伯氨基团数目减少。当溶液pH降低时, 载体的电位值升高, 这主要是由于载体内部的叔胺基团质子化。

Table 1 Size and zeta potential of the polymers. n = 3, x± s
5 PF127-PAMAM对DOX的负载能力及体外释放行为

结果测得每个PF127-PAMAM分子可以负载19.58个DOX分子[22], 包封率为95.0%, 载药量为2.2%。PF127-PAMAM聚合物具有疏水性的内核及亲水性链末端, 可以对疏水性药物起到增溶作用, 因此可用于包载疏水性的DOX分子[25]

PF127-PAMAM/DOX的体外释放结果见图 3。在pH 7.4环境中,48 h内累计释放量不足25%。而在pH 5.5环境中,6 h时的累积释放量即达到了25%; 48 h内累积释放量则高于40%。这表明PF127-PAMAM/ DOX的释放具有pH敏感的特性。该特性主要与电位的变化有关。在酸性条件下PF127-PAMAM带有更高的正电性, 导致其与带正电的DOX分子之间斥力增加, 从而促进DOX释放。PF127-PAMAM/DOX的缓慢释放及pH敏感的性质能够降低DOX对全身的毒副作用, 加快DOX在肿瘤部位等酸性环境中的释放, 有利于抗肿瘤效果的发挥。

Figure 3 Invitro release behavior of PF127-PAMAM/DOX at pH 5.5 and 7.4. n = 3, x± s
6 PAMAM及PF127-PAMAM的溶血性

PAMAM及PF127-PAMAM的溶血实验结果见图 4。材料对细胞膜的破坏具有浓度依赖性, 随材料浓度的增加, 溶血程度也大大增加。当质量浓度为2.5 mg·mL-1时,PAMAM G5的溶血大于50%; 然而, PF127化的PAMAM G5的溶血程度降低到不足1%。这表明普朗尼克化能大大降低PAMAM G5的溶血性。尽管经PF127修饰后, 载体仍带有很高的正电荷, 但其降低溶血性的效果是显著的。这主要归功于PF127的保护作用,PF127具有良好的生物相容性, 可以掩蔽PAMAM表面的正电荷, 保护细胞不与PAMAM表面的氨基接触, 从而降低对细胞膜的破坏作用。

Figure 4 Hemolysis toxicity of the polymers. n = 3, x± s
7 PAMAM及PF127-PAMAM的细胞毒性

PAMAM及PF127-PAMAM对MCF-7、MCF-7/ ADR细胞株的毒性结果见图 5。当质量浓度高达72 μg·mL-1时, 对于MCF-7细胞株,PF127-PAMAM可将细胞存活率由39.64%提高至65.94%; 而对于MCF-7/ADR细胞株, 细胞存活率则由53.76% 提升至90.11%。结果表明,PAMAM的PF127化可以降低材料的细胞毒性。

Figure 5 Cytotoxicity of the polymers against MCF-7 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B) after 48 h incubation. n= 3, x± s
8 PF127-PAMAM/DOX对MCF-7/ADR细胞的抑制作用

考察了一系列浓度的DOX及载药复合物对MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长的抑制作用, 结果见图 6。在MCF-7细胞中, 游离DOX表现出较强的杀伤肿瘤细胞的效果, 其IC50值为0.31μg·mL-1。对于载药复合物, 其IC50值为0.41 μg·mL-1。载药复合物的抑瘤效果稍弱于游离DOX, 主要与其缓慢释放的特 点有关。然而, 在MCF-7/ADR细胞中, 游离DOX表现出较弱的抑制肿瘤细胞生长的效果, 其IC50值为25.86μg·mL-1, 耐药指数达到83.42。而载药复合物则表现出良好的抑制肿瘤细胞生长的效果, 其IC50值为0.78 μg·mL-1, 耐药逆转指数 (RRI) 达到33.15。结果表明,PAMAM-PF127/DOX能很好地抑制MCF-7/ ADR的生长, 可以逆转MCF-7/ADR的多药耐药性。

Figure 6 Cytotoxicities of DOX and PF127-PAMAM/DOX against MCF-7 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B) after 48 h incubation. n = 3, x± s
结论

本实验采用一种简单的方法合成了普朗尼克F127化的PAMAM聚合物载体, 并将其用于包载DOX, 每个载体分子可以包载19.58个DOX分子。体外释放实验表明, 该复合物具有缓释的特点, 并具有pH敏感的性质。通过溶血实验和MTT实验考察PAMAM-PF127的毒性, 结果表明, 相比于PAMAM G5, 经PF127化后, 毒性大大降低, 这主要与其电位降低及PF127的保护作用有关。进一步考察了载药复合物对MCF-7及MCF-7/ADR肿瘤细胞的抑制效果。对于MCF-7细胞, 载药复合物的抑瘤效果稍弱于游离DOX, 这主要与其缓慢释放的特点有关。而对于MCF-7/ADR细胞, 载药复合物表现出良好的抑制肿瘤细胞生长的效果, 具有潜在的逆转肿瘤MDR的作用。

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