药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1194-1199   PDF    
濒危南药白木香悬浮细胞体系的建立
刘娟1, 韩晓敏3, 梁良4, 刘庆昌5, 徐艳红1, 杨成民1, 张争1,2, 孙晶6, 魏建和1,2     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所海南分所, 海南省南药资源保护与开发重点实验室, 海南 万宁 571533;
3. 燕山大学, 河北 秦皇岛 066004;
4. 山东中医药大学, 山东 济南 250355;
5. 中国农业大学, 北京 100094;
6. 东北林业大学生命科学院, 黑龙江 哈尔滨 150040
摘要:以白木香(Aquilaria sinensis) 茎尖为材料,利用诱导形成的愈伤组织构建悬浮细胞体系。结果表明,诱导愈伤组织最适培养基为MS + 2.0 mg·L-1 NAA + 1.0 mg·L-1 6-BA;经12次继代培养的愈伤组织生长旺盛、质地疏松适于悬浮培养;将其置于液体培养基MS + 2.0 mg·L-1 NAA + 1.0 mg·L-1 6-BA + 500.0 mg·L-1 CH中震荡培养,建成悬浮细胞体系。悬浮细胞生长曲线呈S型,初期增长缓慢,4~6天为对数增长期,7~12天进入平台期,12天以后细胞生长速度及活力迅速下降;GC-MS结果显示,培养0、3、6、9、12天悬浮细胞不含沉香倍半萜,使用100 μmol·L-1 MeJA处理24 h可检测到倍半萜。本实验构建的白木香悬浮细胞体系均一稳定、细胞活力良好,可作为研究伤害诱导白木香形成倍半萜的离体体系,同时也具备离体生产沉香倍半萜的潜力。
关键词白木香     愈伤组织     悬浮细胞培养     沉香倍半萜    
Establishment of a cell suspension culture system of endangered Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg
LIU Juan1, HAN Xiao-min3, LIANG Liang4, LIU Qing-chang5, XU Yan-hong1, YANG Cheng-min1, ZHANG Zheng1,2, SUN Jing6, WEI Jian-he1,2     
1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;
2. Hainan Branch Institute of Medicinal Plant, Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Wanning 571533, China;
3. Yanshan University, Qinhuangdao 066004, China;
4. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
5. China Agricultural Univesity, Beijing 100094, China;
6. College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Aquilaria sinensis callus induced by stem tips were used to establish the suspension cell system. The results showed that the most suitable medium for callus induction and subculture is MS + 2.0 mg·L-1 NAA + 1.0 mg·L-1 6-BA. After 12 times of subculture, the energetic and loose callus, which were appropriate for cell suspension culture, were cultured and shook in liquid medium MS + 2.0 mg·L-1 NAA + 1.0 mg·L-1 6-BA + 500.0 mg·L-1 casein hydrolysate (CH) to establish the suspension cell system. The growth curve of suspension cells showed a "S" type. At the beginning of the culture, cell density increased slowly; during 4 to 6 days, suspension cells reached logarithmic growth period; during 7 to 12 days, suspension cells were in the platform period; but after 12 days, cell density and activity went down obviously. Agarwood sesquiterpenes were not detected in the suspension cells during the growth period, however, they could be detected in MeJA treated suspension cells. In this study, a stable and active growing suspension cell system was established, which was a proper system to study the mechanism of agarwood sesquiterpene formation, and additionally provided a potential way to generate agarwood sesquiterpenes through application of cell culture.
Key words: Aquilaria sinensis     callus     suspension cell culture     agarwood sesquiterpene    

白木香 (Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg) 为瑞香科沉香属植物, 属于我国特有的濒危南药之一, 其带有棕黑色树脂的干燥木材作为国产沉香使用[1, 2, 3]。由于沉香具有极高的经济价值和市场需求[4], 导致白木香被过度砍伐, 其野生资源遭到严重破坏[5, 6]。加快发展沉香种植、实现人为干预高效结香成为沉香可持续利用亟待解决的问题, 因此极有必要阐明沉香的结香机制。

悬浮细胞体系 (suspension cell culture) 具有增殖快、去壁容易、次生代谢物易于收集、突变筛选彻底等优点[7, 8], 是机制研究较理想的离体材料。白铭洲等[9]初步建立了白木香悬浮细胞体系, 重点研究 液体培养基配方与悬浮细胞增重的关系, 而对悬浮体系一些关键指标如生长曲线、细胞活力等未报道。Kumeta等[10]及Ito等[11]运用茉莉酸甲酯诱导越南沉香 (A. crassna) 及白木香悬浮细胞生成沉香倍半萜并对δ-愈创木烯合酶进行体外功能验证; Okudera等[12]及何梦玲等[13]运用白木香悬浮细胞研究了色酮类成分的诱导, 但以上文献仅提及用到悬浮细胞体系, 而对悬浮细胞体系如何构建、体系中细胞的特点及生长特性均未提供详细数据, 其他实验室很难重复建立与应用。为此在文献及前期试验基础上本实验室开展了白木香悬浮细胞体系建立的详细研究, 对其生长速度、细胞活力及有无沉香倍半萜等进行探索, 为深入研究伤害诱导白木香形成倍半萜机制及未来应用细胞培养生产沉香倍半萜提供离体材料打下了基础。

材料与方法 材料

实验所用白木香 (Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg) 采自中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 于北京植物温室培养保存。从健康无病虫害、长势健壮的白木香植株上, 采集5 cm左右的茎尖作为外植体。流水冲洗30 min后在体积分数为70% 乙醇浸泡40 s, 冲洗干净后加入浓度为5% 的次氯酸钠浸泡20 min, 无菌水冲洗4次, 无菌滤纸擦干。切成1.0 cm左右长条, 接种到MS培养基上, 诱导愈伤组织。形成的愈伤组织每21天继代1次,25 ℃, 暗培养。

愈伤组织诱导培养基的筛选

以MS为基本培养基, 采用不同激素组合形成15种配方处理 (表 1)。每个处理重复5次 (5皿), 每皿12~20个外植体。连续培养21天后统计愈伤诱导情况。愈伤诱导率 = (诱导愈伤的外植体数/接种未染菌的外植体数) × 100%。

Table 1 Medium design of callus induction
不同悬浮体系的筛选与悬浮细胞生长率的测定

取连续继代4、8、12次质地疏松易碎的愈伤组织, 切碎后称重, 放入250 mL三角瓶, 每种处理3瓶, 每瓶加入100 mL液体培养基, 进行悬浮培养。根据愈伤组织培养基的筛选结果并结合文献报道[9], 确定悬浮培养条件为: MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 2.0 mg·L-1 NAA + 500.0 mg·L-1 CH, 转速100 r·min-1,(26 ± 1) ℃, 弱光。筛选出的悬浮细胞体系进行生长率测定, 悬浮液用60目分样筛 (孔径为250 μm) 过滤, 吸取40 μL滤液进行显微计数, 连续统计15天。细胞密度 = (40 μL悬浮液中细胞个数/40) × 1 000。

细胞活性的测定

荧光染色液配制: 将二乙酸荧光素 (fluorescein diacetate,FDA) 溶于丙酮, 配成浓度为5 mg·mL-1的母液, 避光保存于4 ℃冰箱, 使用前配制所需浓度; 碘化丙啶 (propidium iodide,PI) 用0.65 mol·L-1的甘露醇配成浓度为1 mg·mL-1的母液, 避光置于4 ℃冰箱中保存。荧光检测采用荧光显微镜 (OLYMPUS BX51型, 日本) 观察。FDA单染: 取不同生长天数的白木香悬浮细胞液5 mL, 置于10 mL离心管, 加入FDA母液, 使其终浓度为100 μg·mL-1, 室温下避光放置5 min。PBS液漂洗并制片, 对活细胞进行观察。PI单染: 取不同生长天数的白木香悬浮细胞液5 mL, 置于10 mL离心管中, 加入PI母液, 使其终浓度为60 μg·mL-1, 室温下避光放置5 min。PBS液漂洗并制片, 对死亡细胞进行观察。FDA-PI双染: 取不同生长天数的白木香悬浮细胞液5 mL, 置于10 mL离心管中, 加入FDA, 振荡摇匀后加入PI, 室温下避光放置5 min。PBS液漂洗, 制片观察并统计活细胞与死细胞个数, 平行测定3次, 统计细胞死亡率, 死亡率越高则细胞活性越差。细胞死亡率 = 发红光细胞数 / (发绿光细胞数 + 发红光细胞数) × 100%。

SPME-GC-MS检测白木香悬浮细胞的沉香倍半萜

根据Kumeta等[10]和Xu等[14]方法, 取培养 0、3、6、9、12天的悬浮细胞样品, 真空低温干燥后, 液氮研磨成细粉, 转入7 mL顶空瓶中, 马上用硅树脂的盖子密封盖好。用活化好的固相萃取头 (PDMS/ DVB/CAR,Supelco) 在60 ℃水浴平衡30 min, 顶空萃取30 min。按照陈怀琼等[15]色谱质谱方法, 顶空进样5 min后进行GC-MS分析。用100 μmol·L-1 MeJA处理24 h的悬浮细胞作为阳性对照, 阳性对照的3种倍半萜通过检索NIST08标准质谱图库和文献[10, 11, 12]报道综合鉴定。

结果与分析 1 培养基中不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

茎尖外植体在15种培养基中均能诱导出愈伤组织, 培养7天可观察到外植体明显膨大,12天在外植体的受伤面长出淡黄色的愈伤组织。不同培养基愈伤诱导效果差异显著, 且愈伤的生长状况随着培养时间的延长也呈现显著差异 (表 2)。第21天统计观察,6和10号培养基愈伤诱导率最高, 分别达到82.54% 和81.82%, 且无褐化与玻璃化现象; 其他培养基诱导率均低于70%, 最差的1号培养基诱导率只有10.53%, 且存在明显玻璃化现象。综合愈伤诱导率与生长势,6、10号培养基较好, 但当继代次数超过3次,6号培养基的愈伤组织易褐化, 因此采用10号培养基作为愈伤组织的继代培养基。

Table 2 Effects of different medium on callus induction
2 继代次数不同的愈伤组织对悬浮体系构建的影响

结果表明, 初始愈伤组织的状态和继代次数对悬浮体系的构建有显著影响。继代4次的愈伤组织结构较致密, 其构建的悬浮体系长势很慢 (图 1-a,d), 其细胞团较大, 多为超过60个细胞的细胞团, 而细胞体积较小, 结构比较紧密, 分散性差; 继代8次的愈伤组织结构较为疏松, 其构建的悬浮细胞体系长势较好 (图 1-b,e), 细胞团较大, 多超过50个细胞, 基本观察不到单细胞或小于10个细胞的细胞团, 而细胞大小中等; 继代12次的愈伤组织结构疏松, 构建的悬浮细胞体系长势好 (图 1-c,f,g,h,i), 多以小细胞团或单细胞存在, 细胞体积较大, 生长迅速。

Figure 1 Suspension cell systems constructed by callus with different subculture times. a,d: Four times of subculture; b,e: Eight times of subculture; c,f-i: Twelve times of subculture
3 悬浮细胞的生长曲线

悬浮细胞生长呈S型曲线,1~3天生长缓慢,4~6天为对数生长期,7~12天为平台期,13天后由于培养基中养分的消耗使得悬浮细胞的生长环境恶化, 细胞分裂速度减慢, 细胞密度迅速下降。因此, 该悬浮体系继代培养周期以12天左右为佳 (图 2)。

Figure 2 Growth curve of A. sinensis suspension cells
4 悬浮细胞的活性

悬浮细胞经FDA单染, 活细胞显亮绿色荧光 (图 3A); 经PI单染, 死细胞显红色荧光 (图 3B); 经FDA-PI双染, 可明显区分两种细胞 (图 3C), 用于 评价悬浮细胞的活性。如图 4所示, 悬浮细胞生长 初期, 细胞增殖慢, 细胞死亡率逐渐升高, 到第3天达25.88%; 对数期细胞增殖加快, 细胞死亡率下降 (10%~15%); 悬浮细胞生长后期, 养分不断耗损, 细胞死亡率升高, 第12天后已超过30%, 第15天达到38.1%。由此表明, 白木香悬浮体系的继代周期宜以12天左右为佳, 与悬浮细胞生长曲线结论一致。

Figure 3 Microscopic observation of cell activity. A: Fluorescein diacetate (FDA) stained living cells; B: Propidium iodide (PI) stained dead cells; C: FDA-PI stain; the arrows indicate dead cells

Figure 4 Curve of cell mortality rate of A. sinensis suspension cells (n = 3)
5 悬浮细胞有无沉香倍半萜检测分析

沉香倍半萜属于典型的诱导型药用次生代谢产物[16], 即健康的白木不产生, 只有当树体受到外界伤害后才产生的这类成分。在离体情况下, 沉香倍半萜是否存在于悬浮细胞中、可否被诱导产生需要明确, 因此对所构建的白木香悬浮细胞体系进行定性的化学分析。培养0、3、6、9和12天悬浮细胞均未检测到沉香倍半萜类成分的存在, 采用MeJA处理的白木香悬浮细胞检测到3种倍半萜成分α-愈创木烯、δ-愈创木烯和α-蛇麻烯 (图 5)。3种倍半萜的结构和质谱信息如图 6所示。

图 5 Total ion chromatogram (TIC) of MeJA induced A. senensis cell suspension. 1: α-Guaiene; 2: α-Humulene; 3: δ-Guaiene

图 6 MS spectra of α-guaiene,α-humulene and δ-guaiene. 1: α-Guaiene; 2: α-Humulene; 3: δ-Guaiene; A: Authentic standards; B: MS of sample detected sesquiterpenes
讨论

白木香的幼叶[11, 12]、茎尖[9]及根尖[13]均可诱导形成愈伤组织, 但前期预实验发现, 幼叶产生的愈伤组织在后期继代培养中生长缓慢、易褐化, 而根做外植体极易染菌, 因此采用茎尖进行愈伤组织的诱导, 并筛选出MS + 2.0 mg·L-1 NAA + 1.0 mg·L-1 6-BA作为继代培养的配方。在构建悬浮细胞体系过程中发现, 所用初始愈伤组织的状态和继代次数对悬浮细胞体系构建成功与否具有关键意义, 而之前未见相关报道, 本研究表明, 继代12次且质地疏松、生长旺盛的愈伤组织适于构建悬浮细胞体系。通过对悬浮细胞生长曲线的绘制及细胞活力的测定, 确定适宜的继代周期为12天左右, 继代模式为悬浮-悬浮。本研究首次同时通过生长曲线及细胞活力分析确定所构建悬浮体系的生长周期, 为后期结香机制的研究提供了基础。

沉香倍半萜是沉香最主要的成分之一, 其生物合成途径的阐明及结香机制一直是近几年研究的热点。悬浮细胞体系是一种细胞快速生长的体系, 其培养条件稳定可控, 为研究沉香倍半萜形成机制的理想材料, 也为未来应用细胞培养生产沉香倍半萜提供了一种可能。SPME-GC/MS检测白木香悬浮细胞整个的生长周期中不含有沉香倍半萜类成分, 采用MeJA处理的悬浮细胞可检测到沉香倍半萜, 这与文献报道一致[10, 11, 12, 13, 14]。因此, 本实验所构建的悬浮体系可用于伤害诱导白木香形成沉香倍半萜的研究。

本实验还对沉香中另一类重要成分色酮进行检测, 确定在悬浮细胞整个生长周期中不含有色酮类成分,MeJA诱导后24 h的悬浮细胞也未检测到相关成分, 这与文献相符[12], 可能与诱导时间过短有关; 但也有文献报道[13], 真菌可以诱导白木香悬浮细胞体系生成色酮类成分, 诱导时间较长, 这些均表明色酮与倍半萜的诱导存在明显差异, 提示两者的调控机制很可能不同, 但尚无相关研究报道, 其领域有待更为深入的挖掘。

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