药学学报  2014, Vol. 49 Issue (8): 1208-1210   PDF    
从肽底物到抗丙肝药物特拉匹韦
郭宗儒    
中国医学科学院药物研究所, 北京 100050
1 靶标的确定

1989年发现并确定了丙肝病毒 (HCV),1996年解析了HCV的NS3-4A蛋白酶的晶体结构和它在HCV生长增殖和生命周期的作用,这为基于HCV蛋白酶结构设计丙肝药物提供了结构基础。

NS3-4A蛋白酶是由酶NS3和辅酶NS4A构成 的。NS3是双重功能酶,在N端的丝氨酸蛋白酶和在C端的NTP酶/helicase; NS4A为54肽,与NS3相结合辅助催化作用。NS3与底物结合的活性中心,是由Asp81-His57-Ser139三元体构成,处于两个桶状结构的裂隙处,可作为抑制剂结合的位点,但总的说来,活性中心是一个展开的平坦而疏水的浅表面,这对于设计和确定抑制剂的锚点带来困难。

2 肽类抑制剂

Vertex公司研究发现,某些NS3底物蛋白的N 端裂解产物可抑制NS3蛋白酶的活性,例如NS4A- NS4B的裂解位点生成的NS4A对酶的抑制活性Ki = 0.6 μmol·L-1,肽的抑制作用认为主要是酸性基团,并确定酶的Lys136是结合位点。

水解产物的类似物十肽1具有抑制活性,相对分子质量为1 097,Ki = 0.89 μmol·L-1 (Steinkühler C,et al. Biochemistry,1998,37: 8899-8890),然而1的结构中含有两个羧基,不利于进入细胞 (Larsen SD,et al. Bioorg Med Chem Lett. 2003,13: 971)。

3 肽类结构的优化

以十肽1为起始物,为了提高对NS3蛋白酶的 结合能力,在肽链中加入亲电性基团醛基,以便与催化三元体中的Ser139形成共价键加成产物 (Leung D,et al. J Med Chem,2000,43: 305)。为降低分子尺寸,合成了一系列减少氨基酸残基、在C端含有醛基的肽,发现六肽醛2 (相对分子质量为733,Ki = 0.89 μmol·L-1),但存在两个羧基仍不适宜,去除P6和P5两个酸性残基以有利于进入细胞,化合物3为四肽醛,虽然活性降低为Ki = 12 μmol·L-1,但分子尺寸明显降低,相对分子质量为595,可作为优化结构的新起点。

3.1 P1的优化

化合物3的P1是用乙基代替底物肽的半胱氨酸侧链,活性是否因此减弱,为此,将3的P1用其他基团替换,例如正丙基、CF3CH2等,活性显著增高,但偕二甲基或甲氧乙基的活性降低,可能是体积过大的缘故。因三氟乙基的原料比去甲缬氨酸 (正丙基的载体) 昂贵,故确定P1为正丙基。

3.2 P2的优化

P2是抑制剂的重要位段,它处于NS3蛋白酶的催化三元体部位,加之羟基脯氨酸含有两个属性中心,因此对P2区域作了广泛的构效关系研究。如图 1所示的构效关系 (Perni RB,et al. Bioorg Med Chem Lett,2003,13: 4059-4063)。

图 1化合物3的构效关系
3.3 醛基的优化 3.3.1 亲电基团的变换

具有亲电性的醛基,可与羟基加成,形成共价键。醛基必然处于端基,缺乏选择性,而且化学不稳定。为了优化该亲电基团,将化合物3中的醛基用其他亲电性基团如α卤代酮、杂环 酮、α二酮和α酮基酰胺等替换,发现含α酮基酰胺的化合物4活性提高12倍,Ki = 0.92 μmol·L-1,而其 他基团的取代活性未见提高。4的相对分子质量为742,对感染HCV细胞的抑制活性IC50 = 4.8 μmol·L-1,对正常细胞的细胞毒作用IC50 > 100 μmol·L-1,提示细胞水平具有一点点活性和选择性。此外,还证明P1’区域S-α甲基苄胺活性强于R-异构体。

化合物4与NS3复合物晶体结构表明,Ser139 加成到酮基形成共价结合,酰胺的酮基氧与Ser138和Glu137的N-H形成氢键。图 2是化合物与NS3活性中心形成共价键和氢键结合的示意图 (用粗线表示)。

图 2化合物4与NS3活性中心结合的示意图

另一个里程碑式的化合物5,是P2的苄氧基变换成酰基连接的四氢异喹啉片段,P1为正丙基,P1’为苯丙氨酸。5的相对分子质量为825,对NS3抑制活性Ki < 0.2 μmol·L-1 (Perni RB,et al. Bioorg Med Chem Lett,2004,14: 1441-1446)。

3.4 P2的进一步优化: 脯氨酸环的变化

化合物45的活性虽高,但亲脂性过强,例如4ClogP = 5.4。为此,通过分析化合物6 (相对分子质量为664,Ki = 1.4 μmol·L-1) 与NS3复合物结构的P2特征,发现酶的S2腔穴中有结构水分子的存 在,分子模拟提示,去除水分子后,S2腔可容许有较小基团,推论可在环上加入1~4个碳原子,从而获得熵效应以提高结合力。有代表性的化合物7的相对分子质量为750,Ki = 0.12 μmol·L-1,活性明显提高,当然,P1’处的苯丙氨酸虽有利于与酶结合,但游离羧基不利于透过细胞膜。

3.5 P1’、P3P4的优化

化合物7的P2处小体积化有利于结合,但P1’的羧基不利于过膜,用小分子胺代替苯丙氨酸,P3和P4分别为叔丁基和环己基,其中有代表性的化合物 8的相对分子质量为681,Ki = 0.12 μmol·L-1,对HCV感染的细胞抑制作用IC50 = 0.91 μmol·L-1,对正常细胞的抑制作用IC50 = 59 μmol·L-1,成为新的里程碑化合物。

4 候选化合物的确定和特拉匹韦的成功

至此,由P1’到P4大部分已作了优化,P2的脯氨酸除少数的小烷基取代外,还有并环戊烷的优化,如图 3中所列 (Yip Y,et al. Bioorg Med Chem Lett,2004,14: 251-256)。

P2的脯氨酸并环的优化

将优化各个部位作最佳整合,合成的一系列分子中,化合物9,相对分子质量为680,对NS3蛋白 酶的活性Ki = 7 nmol·L-1,抑制HCV 1b复制的IC50 = 354 nmol·L-1,抑制HCV 1a复制的IC50 = 289 nmol·L-1,对正常细胞的抑制作用IC50 = 83 μmol·L-1,选择性为230~296倍。结构中含有酮基酰胺亲电性基团选择性作用也很高,对其他蛋白酶如凝血酶、胰蛋白酶等抑制作用很弱,选择性超过500。

化合物9命名为特拉匹韦 (telaprevir),2002年 由Boehringer Ingelheim开发率先进入临床研究,治疗慢性丙肝患者,每日口服2次,可降低患者血清中HCV病毒RNA滴度上千倍。FDA于2011年批准上市 (Kwong AD,et al. Nat Biotechnol,2011,29: 993- 1003)。